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甲醛变性电泳甲醛变性电泳
发布时间:2013-06-28        浏览次数:17        返回列表


甲醛变性电泳

所有分类 > 电泳 > 核酸电泳 > 甲醛变性电泳 甲醛变性电泳
心得 (0)
实验原理
提取样品的总RNA后,一般根据RNA的凝胶电泳图来判断RNA的质量。由于RNA容易形成二级结构,因此常用甲醛变性胶来进行RNA电泳,得到的电泳图能真实反映RNA的质量状况。将RNA通过凝胶电泳使之在凝胶中分离出来,通过加入标准核酸分子(markers)对其进行鉴定,并用于转膜、杂交等。


实验试剂
1. DEPC 水的处理:用量筒量取去离子水2L,在通风橱中,加入2ml DEPC到2L去离子水中,终浓度为0.1%的DEPC。迅速盖上盖子,混匀,然后放在摇床中中速摇荡至少4hr,再高压灭菌。灭菌时将瓶盖松开,15磅灭菌20min。
2. 10×MOPS缓冲液(即10×FA缓冲液): 500ml
0.2mol/L MOPS(3-〔N-吗啉〕丙磺酸)                  

80mmol/L NaAc                                                                

10mmol/L EDTANa2                                                              

先用400 ml DEPC水溶解20.6g MOPS和4.1gNaAc后,加入10ml 0.5mol/L EDTA,定容500ml。用0.22mm滤器过滤除菌,装入棕色瓶中,室温避光保存。

或0.2mol/L MOPS(3-〔N-吗啉〕丙磺酸)

50mmol/L NaAc

10mmol/L EDTA
用2mol/L氢氧化钠调节pH至7.0,临用时用DEPC水稀释。
3. 1×MOPS电泳缓冲液(即1×甲醛变性胶电泳缓冲液1×running buffer):1500ml
10×MOPS       150ml
37%甲醛          80ml
加水至1500ml,一般在3次电泳结束后需更换此电泳缓冲液。
4. 5 × 甲醛变性胶加样缓冲液(5×loading buffer): 10ml

预先配制水饱和的溴酚蓝溶液:在1.5ml 离心管中加入约0.1mg溴酚蓝,加入1ml DEPC水溶解,充分振荡溶解,离心,可见离心管底部有溴酚蓝粉末剩余,上层液体即水饱和的溴酚蓝液。在15ml灭菌离心管中,依次加入以下各种成分:
4.0ml      10 × FA buffer
3.1ml      甲酰胺
2.0ml     100%的甘油
720ul      37%的甲醛
80ul        0.5MEDTA (PH 8.0)

16ul        水饱和的溴酚蓝
100ul      DEPC水
混匀,分装,-20℃保存,常用放4℃保存。

或  甲醛凝胶变性RNA电泳加样缓冲液(10×): 10
50%甘油
1mmol/L EDTA
0.25%溴酚蓝
0.25%二甲苯氰
5ml甘油、20ul 0.5mol/L EDTA、25mg溴酚蓝、25mg二甲苯氰,加DEPC水至10ml,高压后,4°C保存。

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