生物发光成像与荧光成像的比较

与荧光成像技术相比较，生物发光成像技术主要的优势有：

1．特异性强，无自发荧光

以荧光素酶作为体内报告源的生物发光方法，是以酶和底物的特异作用而发光，特异性极强。动物本身没有任何自发光，使得生物发光具有极低的背景，极高的信噪比。但用荧光方法时，在受到激发光激发时，生物体中皮肤、毛发和各种组织及食物等都会产生荧光，特别是被标记的靶点深臧于组织内部，需要较高能量的激发光时，也就会产生很强的背景噪音。虽然荧光信号强度远远超过生物发光，但极低的自发光水平使得生物发光的信噪比远高于荧光。

2．高灵敏度

生物体内很多物质在受到激发光激发后，也会发出荧光，产生的非特异性荧光会影响到检测灵敏度。特别是当发光细胞深藏于组织内部，则需要较高能量的激发光源，也就会产生很强的背景噪音。荧光成像的灵敏度最高也只能在动物体内检测到约10⁵细胞，相对于生物发光在动物体内监测到10²数量级细胞的灵敏度要相差很多。

3. 检测的深度

由于生物发光的灵敏度高于荧光成像，对于需要深部成像的研究（检测的深度在3~4cm），如干细胞、原位肿瘤与转移，自发肿瘤等，应用生物发光成像是最佳的选择。

4. 精确定量

生物发光信号可以用于精确定量，因为荧光素酶基因是插入细胞染色体中稳定表达的，单位细胞的发光数量很稳定。即便标记细胞在动物体内有复杂的定位，亦可从动物体表的信号水平直接得出发光细胞的相对数量。而对于荧光，激发光需要穿过组织到达靶点，发射光需要从体内出来，路径较长。信号水平取决于激发光的强度、发光细胞的数量、靶点的深度、光线穿过的组织对其的吸收及散射等因素，使得荧光强度较难定量。荧光成像定量需要仪器的激发光能够保证持续长时间稳定，并均匀照射到动物体表。NightOWL ⅡLB 983成像系统通过荧光光路的特殊设计实现了对激发光的能量控制和调节，根据光源的大小与深浅针对性选择合适的激发装置，并且采用窄波带滤光片，提高了活体荧光成像的稳定性和灵敏度，并且该系统操作简单、费用低廉、不涉及放射性。

在活体动物可见光成像技术中，相对于生物发光成像技术，荧光成像技术的优势主要表现在：

1. 荧光染料、蛋白标记能力强

荧光标记物种类繁多，包括荧光蛋白、荧光分子、量子点等，可以与基因、多肽、抗体等生物分子标记，作为分子探针使用范围广。同时，不同的荧光蛋白或染料还可对样本进行多重标记，同时成像。检测的波长范围从300~1100nm，某些仪器公司还提供全光谱的滤光片实现几乎所有荧光标记的体内成像。

2. 信号强度大

由于荧光是在外界光源激发下产生的能量转移现象，其光子强度较其它光学信号更强，持续时间长，信号所反应的样本信息量更丰富，对信号接收仪器的要求相对较低，仪器不需要必须配备低温冷CCD（如绝对温度＜-80^oC），节省实验成本和购置成本。

3. 实验成本低

相对于活体生物发光成像来说，荧光成像费用低廉，无需注射底物荧光素。荧光发光基团只要在其合适强度的激发光激发下就可以发出定波长的发射光信号，整个反应不需要向动物注射任何昂贵的反应成分，只要保证荧光基团稳定，就可实现随时激发随时发光的效果。

4. 活体动物、动物尸体、器官全部可以进行成像

由于荧光是基于物理能量转移原理，对实验样本的生理状态要求较低，可以实现活体、尸体、尸解组织器官样本的光学成像。而对于生物发光，只有在活细胞内才会产生发光现象。

总之，生物发光和荧光技术，如何互为补充，取长补短，分别满足不同的研究领域，将来的发展方向是两种技术并重。对于不同的研究，可根据两者的特点以及实验要求，选择合适的方法（表11-1）。

以NightOWL ⅡLB 983为例，来说明活体动物可见光成像系统的仪器设计原理。整个仪器由CCD配合密闭性非常好的暗箱、荧光配件、麻醉系统和软件组成。CCD镜头位于暗箱的左上方，荧光光源和光路位于右上方，动物平台（可加热，以保持观察实验动物的体温）位于暗箱的下方，麻醉系统通过管道与暗箱连接。

选择适当的CCD镜头，对于体内可见光成像是非常重要的。选用的CCD镜头对于波长450-700nm的光必须具有非常高的灵敏度和量子效率，而且由于需要探测的光源在皮下几厘米处，其噪声信号要尽可能的小。科研人员经过探索发现，背照射背部薄化冷CCD是唯一合适的选择。这种CCD芯片温度可达<-80⁰C，在该温度下，芯片的暗电流和阅读噪音降到几乎可以忽略不计的水平，同时配合密闭性非常好的暗箱，使得该系统检测生物发光和荧光具有无与伦比的灵敏度。CCD由软件控制升降，自动聚焦，可以获得从3.5厘米到25厘米的连续视野。

成像暗箱屏蔽宇宙射线及一切光源，可以使暗箱内部保持完全黑暗，CCD所检测的光线完全由被检动物体内发出，避免外界环境的光污染。

在荧光配件的设计方面，光源采用75W的钨卤灯，该系统首先实现了荧光激发光源能量从0%-100%可调节，并通过光导纤维反馈控制激发能量在检测时间内保持稳定，有利于定量的准确性。另外，还通过采用均匀照射的激发装置、窄波带的滤光片等保证荧光成像能较好的去除背景噪音的影响，获得清晰的检测结果，较准确的定量数据。

为了对实验动物进行可见光成像，需要将实验动物进行麻醉，以获得期望的观察角度及稳定的数据。对于生物发光成像来说，由于检测的时间较长，一般建议使用气体麻醉。气体麻醉系统组成包括：气体蒸发器、诱导麻醉箱、流量调节阀、单独控制开关的五通道小鼠麻醉室、废气吸收装置等组成。在成像前，将实验动物置入诱导麻醉箱并被麻醉, 然后放入成像暗箱进行观察

软件系统负责仪器控制和图像分析。软件控制镜头的焦距、CCD的升降、曝光时间、滤光片的更换和照明灯的开启等，具有友好的用户界面，操作简便。

1.  细胞标记或动物标记等

进行生物发光实验，首先根据实验内容的不同，用荧光素酶基因标记肿瘤细胞、干细胞、病毒、药物载体或动物，或者用Lux操纵子标记细菌。用荧光素酶基因标记可通过质粒、慢病毒或逆转录病毒等方法进行。

如果进行荧光实验，就用GFP、EGFP或RFP标记肿瘤细胞、干细胞、病毒或动物等，后者用荧光染料（包括量子点）标记需要检测的物质，如抗体，药物载体等。

2.  体外预实验检测

需要检测的细胞、病毒、细菌等标记后，在活体成像前，可以通过多孔板预先检测一下标记是否成功，荧光素酶或荧光蛋白的表达强度等，并据此筛选阳性克隆、绘制标记物的发光梯度曲线等。体外预实验是作为小动物活体成像解决方案中不可缺少的一部分。比如，利用体外预实验初步检测转染荧光素酶的肿瘤细胞发光值，选择转染率相对高且稳定的一批细胞进行体内实验。对于通常进行的细胞检测来说，具体可以通过活体成像仪器检测活细胞的发光强度，也可以通过体外化学发光和荧光检测仪检测细胞裂解液的发光强度。

当用体外化学发光和荧光检测仪时，可以更准确地捕捉到发光值、更稳定的输出发光值。对于生物发光方式而言，实验所需的仪器是微孔板式化学发光检测仪，如Berthold Centro LB 960。对于荧光方式而言，实验所需的仪器是微孔板式荧光检测仪，如Berthold Twinkle^TM LB 970。(图11-7)

     

图11-7 左侧为Berthold Centro LB 960，右侧为Berthold TwinkleTM LB 970

3.  活体成像

首先麻醉实验动物，可采用异氟烷（isoflurane）或克他命/甲苯噻嗪（ketamine/xylazine）混合液麻醉实验动物。如果采用气体麻醉，可先注射底物。气体麻醉的优点是动物可以很快进入麻醉状态，一旦停止麻醉气体供应，动物会在几分钟内苏醒。

对于生物发光实验来说，接着注射底物荧光素。最佳的检测时间是在注射后15到35分钟之间。但需要注意的是，对于不同的动物模型，发光动力学过程并不完全一致，最好先进行预实验确定何时发光信号最强。

成像，对于生物发光来说，检测时间一般是1分钟到5分钟，如果信号特别弱，也可以延长到10分钟，如果信号特别强，也可在1分钟以内。对于荧光来说，检测时间是1秒以内。为节约时间，检测生物发光，最多可同时检测5只小鼠。对于荧光实验，麻醉好就可以马上检测。由于激发光照射的角度会影响检测的信号值，所以荧光实验建议每次只检测1只动物。