苏云金芽孢杆菌ICP基因PCR鉴定的策略与进展
林毅 黄志鹏 陈建武 黄必旺 关雄
摘 要：探讨了PCR鉴定中模板来源、DNA聚合酶、引物的选择等三方面的策略，并从特异复合PCR鉴定、共同复合PCR鉴定、两步复合PCR鉴定、特异PCR鉴定、PCR-RFLP鉴定等五个角度对其进展作了回顾与展望。
关键词：苏云金芽孢杆菌; ICP基因；PCR鉴定;策略与进展
Strategies and Advances on PCR Identification for Insecticidal Crystal Protein Genes of Bacillus thuringiensis
Lin Yi Huang Zhipeng Chen Jianwu Huang Biwang Guan Xiong
(Biotechnology Centre of Fujian Agricultural University,Fuzhou 350002)
Abstract：In this paper，strategies on PCR identification are discussed based on DNA samples、primers and DNA polymerases.Its advances are also reviewed in light of specific multiplex PCR,general multiplex PCR,two-step multiplex PCR,specific PCR,and PCR-RFLP.The problems and perspectives are presented as well.
Key words:Bacillus thuringiensis; ICP genes; PCR identification; strategies and advances
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种自然界中广泛分布的革兰氏阳性细菌，从昆虫、土壤、储藏品及其尘埃、污水和植被等来源上均已分离到，据估计全世界已分离保存的Bt菌株有60 000多个。由于它对鳞翅目、鞘翅目、双翅目等9个目的昆虫和螨类等节肢动物，以及动植物寄生线虫、原生动物、扁形动物等有特异性毒杀作用，具有对人畜安全、害虫不易产生抗性、易于工业化生产等优点，在农业、林业和卫生害虫的防治上得到了广泛应用。进入90年代，Bt产品占全世界生物农药的90 %以上[1～3]。
Bt ICP是单基因直接表达的产物，不同基因型所表达的产物具有显著不同的杀虫特异性。自1981年Schnepf等克隆了苏云金芽孢杆菌的第一个ICP基因,并于1985年发表了它的DNA碱基序列及其编码蛋白的氨基酸序列起,迄今已发现和克隆了170多种ICP基因[4]。因此，弄清ICP基因型，对于菌株鉴定及筛选、杀虫特性的了解、杀虫谱的改良等，都具有重要意义。90年代以来，聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术以其快速、简便、灵敏的特点在Bt ICP基因的鉴定上得到了广泛应用。本文就Bt ICP基因PCR鉴定的策略进行探讨，并对其进展作一回顾。
1 ICP基因PCR鉴定的策略
不同研究者采用的PCR鉴定策略各异，主要表现在模板来源、DNA聚合酶和引物选择等三个方面。由于模板来源及纯度的可塑性，从相当纯的总DNA到细胞粗提物以至菌落，只要其中的杂物不抑制DNA聚合酶的活性，所获得的模板来源均可行。另外，在不同DNA聚合酶催化的条件下，并非所有模板都能以同等效率合成，所以扩增时应考虑不同种类DNA聚合酶的选择。
引物的选择大致可归为以下几类：（1）特异引物直接鉴定目的基因；（2）数对通用引物复合扩增鉴定大类基因，再用一系列特异引物对复合扩增鉴定已知的基因型以及与之同源的未知基因型；（3）共用3'端保守引物,一系列5'端特异引物附着在不同的靶位点上,根据产物分子量可判断基因型；（4）以一对保守引物扩增出同源基因的相应区段(包括已知与未知基因的保守序列和非保守序列)，经适当的限制性内切酶酶切分析，与已知基因的限制性片断长度多态性(RFLP)图谱进行比较，就可以鉴定出待测菌株中所存在的已知基因，如果出现特异性片断，说明可能存在新基因；（5）简并引物及位于简并引物内部的一系列特异引物混合扩增,可很快检测出新基因型。
2 PCR技术在Bt ICP基因鉴定中的应用
2.1 特异复合PCR鉴定 一组特异引物复合一次扩增鉴定多种基因型。美国北卡罗里纳CIBA-Geigy生物技术研究所Carozzi等(1991)应用PCR技术快速预测Bt菌株的杀虫活性。利用12～20个针对cryIA、cryIⅤ 和cryⅢA的特异引物，进行一次扩增，即可鉴别不同菌株对鳞翅目、双翅目和鞘翅目的活性[5]。他们所设计的引物为同行广泛采用[6～7]。加拿大Laval大学Bourque等(1993) 混合使用cryIA(a)、 cryIA(b)和cryIA(c)基因型特异引物，对新分离的Bt菌株进行鉴定[8]。哥伦比亚国立大学Ceron等(1994)用多克隆抗血清(针对cryIA(b)、cryⅢA和cryIⅤ毒性片段) ELISA分析Bt新菌株，对确认为含有cryI型基因的菌株，进一步作PCR分析。以少量的细菌裂解物为模板来源，用反应混合物A(含7条特异引物CJ1-7), 鉴定cryIA-ID 4个不同亚类基因；用反应混合物B(含6条特异引物CJ8-13), 鉴定cryIA(a)-(d) 4个不同小类基因[9]。
2.2 共同复合PCR鉴定 3'端共同引物和5' 端特异引物复合一次扩增鉴定多种基因型。福建农业大学生物技术中心关雄等(1995)利用cryI基因 3'端共同引物和cryIA(a)、cryIA(b)、 cryIA(c)基因型5' 端特异性引物,经PCR扩增,对Bt 8010 cryIA亚类基因进行了鉴定[3]。华中农业大学农业部微生物重点实验室刘子铎等(1997)利用cryI基因 3'端共同引物和cryIA至cryIF 8种亚类5' 端特异性引物,对Bt营养体直接进行PCR分析 [10]。
2.3 两次复合PCR鉴定 需经两次扩增才实现基因型鉴定目的。1995年Ceron等运用一种新的PCR技术，快速鉴定已知的cryI及cryⅢ基因型。以2对通用引物进行一次扩增分析，对含有此类基因型的菌株，用各种特异引物进行二次扩增分析，可鉴定出10种cryI基因型及5种cryⅢ基因型[11]。法国CIRAD的Juarez-Perez等(1997)为鉴定ICP新基因，创立了E-PCR （exclusive PCR）技术。以片段，并从该片段内部选择设计了一系列特异引物扩增特定的cryI基因型，待测菌株中不存在未知的cryI基因型时，特异引物的竞争力胜过简并引物，家族片段将无法产生；如果至少存在一种新的cryI基因型，产物中将出现家族片段。混合应用简并引物和特异引物进行一次扩增分析,鉴定出已知的cryI基因型,然后经二次扩增分析, 排除已知基因,检测出未被识别的未知基因型 [12]。以色列Ben-Gurion大学生命科学系Ben-Dov等(1997)运用两次复合PCR，快速鉴定对鳞翅目、鞘翅目、双翅目害虫有效的ICP基因。设计的5对通用引物，可扩增出20种cry1、3种cry2、4种cry3、2种cry4、2种cry7和以及3种cry8基因型的相应区段。之后，以一套特异引物进行二次扩增分析，鉴定出具体的基因型。对126个新菌株的鉴定结果发现，存在22种不同的cry基因组合，其中38个菌株可能含有与cry7、cry8同源的未知基因[13]。
2.4 特异PCR鉴定 一次扩增反应只鉴定单个基因型。美国Sandoz公司Kalman等(1993)首创了PCR footprinting鉴定技术。从cryIC型基因序列高变异区选择设计了6对特异引物，经PCR扩增，比较不同菌株扩增的指纹图谱，即可鉴定出已知的和新的cryIC型基因。运用该方法在蜡螟变种DH29菌株中发现了cryIC(b)新基因[14]。该技术已引起人们广泛兴趣，1994年台湾Chak等和1998年我国高梅影等也分别开展了此项工作[7,15]。
2.5 PCR-RFLP鉴定 基因型的鉴定有赖于扩增产物的限制性酶切分析。日本北海道大学农学部浅野真一郎等(1993)根据cryⅡ扩增产物的HincⅡ酶切片段长度多态性区分cryⅡA与 cryⅡB。该方法能有效地鉴定出对鳞翅目和双翅目害虫均有效的Bt菌株[16]。新西兰奥克兰园艺及食品研究院Gleave等(1993)从21个Bt血清型中扩增出的7个cryⅤ类基因扩增产物,经KpnI酶切分析,至少可将它们分为三个亚类[17]。台湾国立扬名大学生命科学院Kuo和Chak(1996)明确提出了PCR-RFLP鉴定体系，并首先对成员众多的cryI 类基因进行了系统鉴定[18]。国内对PCR-RFLP鉴定体系也显示出极大热情。1998年，中国农科院植物病虫害生物学国家重点实验室率先开展了这方面的工作，建立了cry2、cry3、cry4/10和cry5基因的鉴定体系，并进一步将Kuo和Chak所能鉴定的11种cry1/7/9基因家重点实验室建立了cry 1、cry2、cry3、cry4、cry5、cry7、cry8、cry9、cry19、cyt1和cyt2等类型基因的鉴定体系[20]。
3 问题与展望
分子生物学飞速发展的一个重要因素是其把新技术和利用新技术积极解决新问题有效地结合起来。PCR使Bt ICP基因鉴定变得简单易行，就代表了这样一种变化。以往，对Bt ICP基因的鉴定，人们曾设想用基因组DNA指纹图谱及生化测定，但该法不适于大量鉴定；而Southern杂交与单克隆抗体因昂贵费时等原因也受到限制。Bt新菌株ICP基因内容的系统鉴定有两条途径。一是两步复合PCR或共同复合PCR，主要用于已知基因的鉴定，需要合成多条引物，而且基因型的复合鉴定不及分开鉴定可靠。二是PCR-RFLP，该方法无疑较为理想，仅需数对引物，即可鉴定出已知的基因，并检测出未知的基因。但PCR-RFLP也存在一些问题，如两保守区间非酶切位点部位的一些重要变异可能被忽略等。此外，PCR-RFLP还可以测定基因拷贝数及定量测定转录水平的表达量差异[20]。
特异PCR 鉴定中，PCR footprinting技术作为检测新型目的基因的“法宝”将倍受青睐。它可以检测出基因内部的细微差异，但需要合成较多引物，成本较高。不可否认，PCR鉴定本身也存在诸如低拷贝杀虫基因可能被忽略、沉默的杀虫基因干扰杀虫活性的预测等缺陷,特别是为寻找对靶虫更有效或结合靶虫不同受体的毒蛋白时,无法提供直接信息。PCR鉴定发现，Bt野生菌株中存在“杂合基因”,是研究ICP基因进化的极好材料。经鉴定含有单基因类型的菌株,为研究单基因的结构与功能及进行基因间组合,为研究基因间的相互作用提供了很好的材料。
科技部"九五"攻关课题96-C01-02-01及国家计委85-504-21-01攻关课题
林毅(福建农业大学生物技术中心，福州 350002)
黄志鹏(福建农业大学生物技术中心，福州 350002)
陈建武(福建农业大学生物技术中心，福州 350002)
黄必旺(福建农业大学生物技术中心，福州 350002)
关雄(福建农业大学生物技术中心，福州 350002)
参 考 文 献
1.喻子牛. 苏云金杆菌.北京: 科学出版社, 1990
2.Drion G B,et al.Principles of Insect Pathology.Boston/Dor drecht/London:Kluwer Academic Publishers,1998
3.苏云金芽孢杆菌8010的研究. 北京: 科学出版社,1997
4.http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil-Crickmore/Bt/ toxins.l updated 15/7/99
5.Carozzi N B,et al.Prediction of Insecticidal Activity of Ba- cillus thuringiensis Strains by Polymerase Chain Reaction Product Profiles.Appl Environ Microbiol,1991,57(11): 3057～3061
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10.刘子铎,等.利用PCR技术直接鉴定苏云金芽孢杆菌杀 虫晶体蛋白基因型的快速方法.微生物学杂志,1997,17 (2):5～8
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16.浅野真一郎,等.PCR法にょゐBacillus thuringiensis cryⅡ 遗传子の增幅と同定.日蚕杂，1993,62(3):223～227
17.Gleave A P,et al. Screening by Polymerase Chain Reaction of Bacillus thuringiensis serotypes for the Presence of cryⅤ -Like Insecticidal Protein Genes and Characterization of a cryⅤ Gene Cloned from B .thuringiensis subsp.kurstaki. Appl Environ Microbiol,1993,59(5):1683～1687
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