过度螺旋的电话线会使总长度变短，限制通话人移动的距离。St.Jude儿童研究医院Delft大学研究人员说，喜树碱（camptothecins，可用以治疗癌症）杀灭癌细胞的机理与此相似。拓扑异构酶（topotecan poisoning）的拓扑替康(topotecan,TPT)中毒，是通过迫使DNA堆积超螺旋激发细胞自杀的。
利用名为磁性镊子（magnetic tweezers）和酵母细胞，研究人员发现喜树碱类药物拓扑替康（topotecan）通过抑制DNA拓扑异构酶I解螺开DNA双螺旋，杀灭癌细胞。紧密扭曲的DNA双链被称作超螺旋（supercoils），从过度缠绕的DNA分子上突出出来，如同过度缠绕的电话线的突出部份。如果这些超螺旋积聚并“顽固不化”，那么细胞在准备分裂而欲将DNA双链分开时会死亡。
在这项突破性研究中，研究人员利用微型磁性镊子监控拓扑异构酶I引起的单个DNA分子的长度变化，研究单个拓扑替康分子与酶-DNA复合体相结合，改变DNA解链状态的方式。根据这些结果，研究人员发展了超螺旋理论，解释药物杀灭癌细胞的机理，然后在酵母细胞中检测该理论。文章刊登于近期Nature杂志。
在细胞分裂之前，一个细胞机器拉开DNA双链，将两条连分为叉骨状的复制叉。双链分离是染色体复制的关键步骤，但这会增加复制叉头部DNA的张力，引起其弯曲为双螺旋。为保证复制叉持续拆开双链DNA，细胞利用拓扑异构酶I在超螺旋DNA两条链中的一条的核酸骨架上开出一个临时性的刻痕，这样消除了超螺旋，使复制叉能够继续分开双链。拓扑替康恰恰是利用了细胞准备分开双链时拓扑异构酶I与双链DNA结合的性质。
已知道拓扑替康通过与拓扑异构酶和DNA链上的刻痕结合，捕获拓扑异构酶。拓扑替康-拓扑异构酶-DNA复合体改变为障碍物，抑制复制叉前进。目前的流行观点认为，拓扑替康杀灭癌细胞很容易，因为复制叉与捕获的拓扑异构酶冲突。Bjornsti的研究结果显示，复制叉头部积聚的正超螺旋才是细胞自杀的主要原因。
研究人员利用磁性镊子技术，将磁珠上的双链DNA分子的一端绑定在玻璃表面，另一端保持静止，然后旋转一个罩在磁珠上部的微型磁铁，结果携带DNA的磁珠跟着旋转，将DNA扭曲为超螺旋，将其长度缩减到不到原来的1/7。
向DNA添加拓扑异构酶，超螺旋会在几秒钟内解开，恢复原长。这说明酶在超螺旋上形成了一个缺口，消除了张力，使DNA伸展到原长。但存在拓扑替康时，拓扑异构酶解开DNA的速度会下降20倍。然而，奇怪的是药物结合减慢拓扑异构酶解开过度缠绕的DNA（正超螺旋）比DNA链重新缠绕为负超螺旋还要多。
研究人员发现拓扑替康偏向于减慢正超螺旋DNA的解开速度，提示DNA超螺旋实际上是抑制复制叉前进，刺激细胞死亡。Bjornsti等决定通过研究喜树碱（拓扑替康是喜树碱的一个类似物或相关药物）对处于基因表达过程中的酵母细胞的效果，检测这个模型。Bjornsti小组首先将双链DNA环（质粒）插入酵母细胞中，得到一个研究喜树碱效果的模型。
基因表达过程中，DNA链是分开的，细胞能够将遗传信息拷贝到RNA中。与DNA复制一样，基因表达需要DNA链的伸展，不同的是，转录机器产生的是mRNA。随着基因转录，DNA的解开在转录机器的前方形成正超螺旋，后方形成负超螺旋。
当研究人员添加拓扑异构酶后，正超螺旋和负超螺旋以相同的速度消失，似乎是正超螺旋的消失是由与之相似的负超螺旋的消失平衡的。当再加入药物喜树碱后，拓扑异构酶解开正超螺旋的速度比负超螺旋消失的速度慢。这种现象证明拓扑异构酶的喜树碱（或拓扑替康）中毒，偏爱于刺激正超螺旋在解开DNA的复合体（如转录机器和复制叉）的头部聚积。
然而，喜树碱不会引起正超螺旋在酵母细胞中聚集，酵母细胞表达的拓扑异构酶对这种药物有抗性。这进一步证明喜树碱类物质如拓扑替康，通过抑制拓扑异构酶解开正超螺旋而将细胞杀灭。
原始出处:
Nature 448, 213-217 (12 July 2007) | doi:10.1038/nature05938; Received 6 January 2007; Accepted 15 May 2007; Published online 24 June 2007
Antitumour drugs impede DNA uncoiling by topoisomerase I
Daniel A. Koster1, Komaraiah Palle2, Elisa S. M. Bot1, Mary-Ann Bjornsti2 & Nynke H. Dekker1
Kavli Institute of Nanoscience, Faculty of Applied Sciences, Delft University of Technology, Lorentzweg 1, 2628 CJ Delft, The Netherlands
Department of Molecular Pharmacology, St Jude Children's Research Hospital, 332 N. Lauderdale, Memphis, Tennessee 38105, USA
Correspondence to: Nynke H. Dekker1 Correspondence and requests for materials should be addressed to N.H.D. (Email: n.h.dekker@tudelft.nl).
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Increasing the ability of chemotherapeutic drugs to kill cancer cells is often hampered by a limited understanding of their mechanism of action. Camptothecins, such as topotecan, induce cell death by poisoning DNA topoisomerase I, an enzyme capable of removing DNA supercoils1, 2, 3, 4. Topotecan is thought to stabilize a covalent topoisomerase–DNA complex5, 6, 7, rendering it an obstacle to DNA replication forks2, 3, 8, 9. Here we use single-molecule nanomanipulation to monitor the dynamics of human topoisomerase I in the presence of topotecan. This allowed us to detect the binding and unbinding of an individual topotecan molecule in real time and to quantify the drug-induced trapping of topoisomerase on DNA. Unexpectedly, our findings also show that topotecan significantly hinders topoisomerase-mediated DNA uncoiling, with a more pronounced effect on the removal of positive (overwound) versus negative supercoils. In vivo experiments in the budding yeast verified the resulting prediction that positive supercoils would accumulate during transcription and replication as a consequence of camptothecin poisoning of topoisomerase I. Positive supercoils, however, were not induced by drug treatment of cells expressing a catalytically active, camptothecin-resistant topoisomerase I mutant. This combination of single-molecule and in vivo data suggests a cytotoxic mechanism for camptothecins, in which the accumulation of positive supercoils ahead of the replication machinery induces potentially lethal DNA lesions.
