1993年,Lee 等在秀丽广杆线虫 (Caenorhaditis elegan)上发现了第一个能时序调控胚胎后期发育的基因lin-4(Lee et al.,1993).2000年,Reinhart等再次在C.elegans 中发现了第二个异时性开关基因let-7,并将这些长度约为22个核苷酸的小分子RNA称为小短暂RNA(small temporal RNAs,stRNA) (Reinhart et al.,2000; Pasquinelli et al.,2000).stRNA是研究miRNA(microRNA)的起始点. 现已发现miRNA广泛存在于许多真核模式生物和细胞中,它们是一类长度为21~25nt的单链RNA分子片段,属于非蛋白编码RNA,其生成与siRNA相似. miRNA和siRNA(short interfering RNA)都是体内非编码的小RNA基因,它们有许多相似之处并在生命活动中发挥了重要的调控作用.
(1). miRNA的特点
miRNA具有以下几个特征:
a. miRNA一般来源于染色体非编码蛋白区的一段,本身不具有开放阅读框(ORF);
b.成熟的miRNA长度通常是21~25nt,其5’端有一磷酸基团,3’端为羟基,但在3’端可以有1~2个碱基的长度变化.可通过Northern blotting 检测到;
c. miRNA能够通过碱基互补配对结合于基因序列的侧翼区域(Ruvkun et al.,2001;.Lagos-Quintata et al.,2001;Lau et al., 2001);
d. 多数miRNA在进化上高度保守,各种miRNA都能在其他种系中找到同源体.最为显著的例子就是在昆虫和哺乳动物hnRNP基因的内含子中都发现mir-7的存在(Aravin et al.,2003).
e. miRNA基因不是随机排列的,从同一个前体RNA加工而来的共表达miRNA存在基因簇(gene cluster)现象(Ruvkun et al.,2001;Lagos-Quintata et al.,2001;Lau et al.,2001).尽管大多线虫和人类的miRNA 基因并不成簇(Lim et al.,2003a,2003b),但在果蝇中超过一般的miRNA是成簇出现的(Aravin et al.,2003).
f. miRNA表达具有细胞特异性和组织特异性.在组织培养的Schneider-2细胞可发现miR12,但是检测不到miR3~miR6的存在(Lagos-Quintata et al.,2001).miR171在拟南芥的花序和花组织中高表达,而在茎和叶组织中却没有表达的迹象(Reinhart et al.,2002).miRNA在不同的细胞和组织中表达,显示了它们在控制个体发育中的特定功能.
g.大多数miRNA的表达具有时序性.mir3~mir7基因只在果蝇胚胎形成时表达,而miR1,miR12的含量在果蝇幼虫阶段急剧上升并在成虫期维持较高水平,同时,在所有阶段都存在的miR9和miR11的含量却急剧减少(Lagos-Quintata et al.,2001).
(2). miRNA的功能
miRNA的主要功能很可能是进行转录后调控,目前已经知道miRNA的功能多与发育的时序调控有关,但也参与了空间发育,应激性,细胞周期和基因重组等过程(McManus et al.,2002).某些miRNA与RISC(RNA-induced silencing complex)相关,能导致靶mRNA的裂解,产生基因沉默(Kindet et al.,2003).另外, miRNA还很可能与人类的某些疾病也有关联.在慢性淋巴细胞白血病病人中发现miR15和miR16这两个基因的表达有缺失或下调现象.这说明了miRNA很可能与人类肿瘤有关(Calin et al.,2002).最近研究还发现,miRNA还参与果蝇中的脂肪代谢(Xu et al.,2003)、在植物中控制叶和花的发育(Aukerman and Sakai,2003;Emery et al.,2003;Palatnik et al.,2003)、以及在哺乳动物中造血细胞的分化(Chen et al.,2004).在各类小RNA中, miRNA可能具有最广泛的基因调节功能,它能对基因活动的各个层面进行调节,其中大多的具体过程还需要我们进一步的研究.
(3). miRNA的作用机制
miRNA与siRNA的作用机制类似.
a. 动物miRNA的生成
大多数miRNA并不是经由自己的启动子转录而来,而是来自内含子的加工(David and Bartel.,2004).体内试验表明miRNA先由长的内源性转录本(pri-miRNA)生成~60-70nt的miRNA前体(pre-miRNA), 此过程是在Drosha RNase III 内切酶催化下在细胞核内完成的(Lee et al.,2003).pre-miRNA是长约70nt的非编码的RNA,它由内源性基因的DNA反向重复序列转录而来并且具有茎-环结构.接着通过Ran-GTP和输出受体Exportin-5把pre-miRNA从核内转运到细胞质中(Lund et al.,2004).然后在细胞质中通过Dicer把pre-miRNA加工为成熟的miRNA(Lee et al.,2002;Zeng and Cullen,2003). Dicer酶是一类多结构域的RNA酶III样蛋白,因参与形成siRNAs而被首次发现.产生miRNAs和产生siRNAs的过程中,Dicer的作用机制类似.它都是通过对茎-环结构的pre-miRNA的剪切,首先生成一个不稳定的双链RNA分子中间物即miRNA:miRNA*duplex,然后被解旋酶(未发现)降解为长度约22个核苷酸,5’端为单磷酸基,3’端为羟基的单链RNA 即miRNA(Hutvaner et al.,2001;Elbashir et al.,2001). miRNA是pre-miRNA茎中的一个臂,可定位于5’端的臂或3’端的臂. (见图1)
b.动物 miRNA的作用机制---翻译抑制
图1. miRNA产生阻遏和siRNA指导RNAi的共同途径的模型(Hutvagner et al.,2002)
小RNA双链复合物推测是短时存在的中介物
miRNA需结合在一个约550kDa(15S)的含有PPD(PAZ&Piwi domain)蛋白核糖核蛋白(miRNA ribonucleoprotein complex,miRNP)中发挥生物学功能(Schwarz and Zamore,2002).人类miRNP中现已发现含有elF2C2,Gemin3和Gemin4等蛋白(Mourelatos et al.,2002).其中elF2C2为Argonaute 类似物,是siRNA诱导的RISC(RNA-induced silencing complex)组分之一.由此可见,miRNA和siRNA有这类似的作用机理.随后发现植物miRNA可以降解天然的靶基因(Tang et al.,2003),而siRNA也可以引起翻译抑制(Doench et al.,2003).
单链的miRNA再被PPD蛋白家族成员识别结合,形成一个RNA-蛋白复合体,即miRNP(类似于RISC),进而形成了成熟的miRNA.然后以反义RNA的形式与靶基因3’端非翻译区(UTR)的特殊位点结合抑制其翻译从而调控基因的表达(Leave et al.,2002). 在整个加工过程中,Dicer酶的识别核加工过程需要ATP供能,而后来与PPD蛋白质家族的识别结合却不需要ATP的参与(Holen et al.,2002).动物miRNA一般通过对靶基因的不完全配对(imprecise base pairing)从而抑制靶基因的翻译,但是并不引起靶基因的降解.如lin-4(Olsen and Ambros,1999).Brennecke 等利用人工构建的对bantam miRNA完全互补的靶基因证实了miRNA一样可以引起靶基因的降解(Brennecke et al.,2003).(如图2所示) 进而发现植物中miRNA通过对靶基因的完全互补而导致其降解(Tang et al.,2003).
c.植物miRNA的作用机制—切割降解
植物miRNA的茎-环结构变化较大,这可能和它的生成过程有关.在植物中miRNA双链中间物的产生过程和动物不同.在DCL1存在的情况下,Drosha能催化pri-miRNA转变为pre-miRNA(Papp et al.,2003).DCL1是一种Dicer类似蛋白,它能协助植物miRNA的生成(Reinhart et al.,2002).然后,在DCL1或其他类似蛋白的作用下,通过对pre-miRNA的茎环结构的剪切,从而在细胞核内生成中间物:miRNA:miRNA*duplex.然后在Exportin-5的类似物HASTY的作用转运到细胞质中(Lund et al.,2004).与动物miRNA一样,该中间物经过某种解旋酶的作用后成为单链的miRNA而被定位于RISC.RISC通过碱基间精确的互补配对结合于靶mRNA,从而导致mRNA的切割降解.这和siRNA导致的靶基因的切割降解作用完全一致.切割位点都在配对碱基10与11之间.
miR172是一种植物miRNA,虽然它可以和靶基因APETALA2精确配对,但是却只能使该基因翻译抑制而不会引起对该基因的切割降解(Aukerman and Sakai,2003;Chen,2003).有意思的是有些植物中的miRNA即使不能和靶基因5’端精确配对,也同样导致靶基因的切割降解(Kasschau et al.,2003;Palatnik et al.,2003).研究发现,也许靶基因的最终抑制或切割不是由siRNA或miRNA所决定,而由靶基因本身所决定.支持这一观点的例子很多,比如已经发现siRNA也可以引起翻译抑制(Doench et al.,2003).
(4).miRNA和siRNA的区别与联系
miRNA和siRNA同为非编码蛋白的小RNA基因,并且都经Dicer作用而形成的产物.因此它们之间存在许多共同的特点,但同时也存在许多不同.
miRNA
siRNA
来源
内源转录本
转基因或病毒RNA
前体
发夹结构的pre-miRNA
双链结构的dsRNA
作用酶
Dicer或Dicer like proteins
Dicer
作用方式
不完全互补或完全互补
完全互补
作用特异性
相对较低
高
作用部位
蛋白质合成水平
转录后水平
长度
~22nt
~22nt
功能
发育过程中,调节内源基因的表达
抑制转录子活性和病毒感染.另还与表型遗传有关
靶基因命运
抑制翻译或被降解
被降解
(5).展望
miRNA的研究被<<science>>杂志列为2002年世界十大科技突破之首.miRNA的广泛存在与进化保守性也暗示着它在生命活动中必定起着十分广泛的调节作用,对基因表达,生长发育和行为等都具有十分广泛和深远的效应.然而,我们对其认识并不深刻.还有许多问题需要我们进一步的探索.
