生物谷报道:体细胞核移植通常采用电融合法和直接注射法。电融合法是用去核管(外径25-30µm)注入到去核卵母细胞质透明带下即卵周隙,但要保证细胞膜的完整,才能使供体细胞膜与卵母细胞质膜粘合在一起,有利于融合。最后通过电融合,使得二者合二为一,当然最后仍然需要激活才可以使得重组胚发育。
而直接注核法,通常是用较细的注核针(外径10-15µm)反复抽吸供体细胞使其质膜破裂,然后直接注入到去核的卵母细胞胞质中。这里的供核要求质膜破裂,有助于释放核进行再程序化。注核之后仍然需要激活,使重组胚进行随后的发育。
目前在猪的体细胞核移植上,文献上大多采用的是直接注射法。而本文与同不同的地方就是采用直接注核,将一个完整的体细胞(供核)直接注入到胞质中,然后通过染色,发现成纤维细胞的核膜在注射后6小时,膜已经破裂了,从而进行随后一系列的发育,得到了克隆猪仔。文中给出精美图片,很有说服力。
生物谷专家认为,文中给出的可能的解释有二:一是卵母细胞积极地识别了供核细胞的质膜或者是其表面的附属蛋白,而这种识别将导致卵母细胞很快降解供核细胞的质膜或者将之运输到卵母细胞的表面,这种活跃的分解作用随之将释放核进行再程序化。二是在整个供核注入到胞质过程中,机械力量可能将供核细胞膜弄破了,那么破漏质膜将释放核,造成核的再程序化。
事实上,很多文献报道,直接注射法比融合法构建重组胚的效率高。Trounson等(1998)等发现,牛体细胞的直接注核法是克隆牛胚胎的一种相对有效的途径。同样用直接注射法也得到了体细胞核移植小鼠(Wakayama et al., 1999; Baguisi & Overstrom, 2000)、猪(Onishi et al., 2000)、山羊(郭继彤,2000)。研究发现,由于体细胞与卵母细胞的体积相差很大,相容性也差,电融合构建胚胎比较困难(Kubota et al., 2000),远低于直接注射法构建的效率(Trounson et al., 1998),所以直接注射法在体细胞核移植研究中有被广泛应用的趋势。而本文的研究又给出了一个很有利的证明。
FIG. 1. The whole-cell injection procedure and cloned embryos. A) A fibroblast cell (arrowhead) is aspirated into the injection pipette. B) The cell is expelled into the cytoplasm of the enucleated oocyte. C) Verification of the absence of the donor cell in the injection pipette. D) Hatched blastocysts (Day 6) produced by whole-cell injection of fibroblast cells. Original magnification x100
FIG. 2. Nuclear events following whole-cell injection. A) Plasma membrane of fibroblast cells was stained with live-membrane fluorescent dye (green). The injected cells were visible in the oocytes' cytoplasm following injection. B) The fibroblast nucleus (arrowhead) stained with Hoechst 33342 (blue) was observed 6 h following cell injection at which time the plasma membrane of the donor cell was no longer visible. C) Full nucleus swelling (arrowhead) was observed 12 h after oocyte activation. D) Hatched blastocysts injected with fibroblast cells. E) A hatched blastocyst stained with Hoechst 33342. Original magnification: A), x75; B/E), x200; C/D), x150
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