微生物学报Acta Microbiologica Sinica
48(6)：711~716; 4 June 2008
基金项目: 国家自然科学基金(30671192, 30470001); 国家资源平台项目(2005DKA21208-3)
*通讯作者。Tel/Fax: +86-531-88564288; E-mail: lilab@sdu.edu.cn
作者简介: 蒋德明(1978. ), 男, 浙江人, 博士研究生, 研究方向为微生物生态学和系统分类。E-mail: jiangdeming@mail.sdu.edu.cn
蒋德明，周秀文，田晓翔，吴志红，李越中*
(山东大学生命科学学院，微生物技术国家重点实验室，济南 250100)
摘要：【目的】利用16S rRNA 和HSP60 基因分子标记分析鉴定形态分类特征不稳定的粘细菌种属。【方法】利用粘细菌的传统分离纯化方法从土壤中分离粘细菌，根据菌株的形态特征进行分类，PCR方法扩增菌株的16S rRNA 和HSP60 基因序列并进行系统发育关系分析。【结果】根据形态特征，分离得到的15 株粘细菌菌株归入孢囊杆菌亚目（Cystobacterineae）的2 个科3 个属。其中11 株粘细菌具有典型的所在种属的子实体结构，而菌株0085-4、0121-3、NM03 和Myx9736 的子实体结构发生了不同程度退化。15 株粘细菌的16S rRNA 基因序列的相似性在95.4%到99.5%之间。而HSP60基因序列差异较大。【结论】在属水平上，粘细菌形态分类特征和16S rRNA 基因系统进化关系具有很好的一致性；在揭示粘细菌种间系统发育关系中，HSP60 基因序列更为适用。
关键词：粘细菌；分类；形态；16S rRNA 基因；HSP60 基因
Phylogenetic analysis of the 16S rRNA and HSP60 gene sequences of the morphology-based taxa of myxobacteria
Deming Jiang, Xiuwen Zhou, Xiaoxiang Tian, Zhihong Wu, Yuezhong Li*
(State Key Laboratory of Microbial Technology, College of Life Science, Shandong University, Jinan 250100, China)
Abstract: [Objective] Using the 16S rRNA or HSP60 gene sequences to identify the myxobacteria taxa at the levels of species and genus, which were difficult to be classified by their morphological characteristics. [Methods] 15 myxobacterial strains were isolated using the traditional isolation methods, and classified based on their morphological characteristics. The 16S rRNA and HSP60 gene sequences were amplified by PCR methods, and phylogenetically analyzed. [Results] Eleven strains possessed typical morphological characteristics, while the other four strains 0085-4, 0121-3, NM03 and Myx9736 were degenerated of fruiting body structures in different extents. The strains were classified into the suborder Cystobacterineae, located in three genera of two families based on their morphological characteristics. The 16S rRNA gene sequences were 95.4% to 99.5% homology, which were in good consistence with the classification of the morphology-based genera; while the HSP60 gene sequences were in longer phylogenetic distances. [Conclusion] The present morphology-based classification of myxobacteria is highly consistent with the phylogenetic results of 16S rRNA gene sequences at the levels of genera or higher taxa; while HSP60 gene sequences provides a more efficient method for identification of closely related myxobacteria species.
Keywords: myxobacteria; taxonomy; morphology; 16S rRNA gene; HSP60 gene
粘细菌由于具有复杂的细胞社会行为（ socialbehavior）和能形成多细胞聚集、形态特异的子实体结构而被视为“高等细菌”[1,2]。具有鲜明色彩的子实体是在环境条件恶劣或营养条件贫瘠的情况下，由成千上万的营养细胞聚集并分化发育而成的[3]。由于子实体及其内含粘孢子的抗逆性，粘细菌能够广泛地分布在地球的各个地方，特别在土壤、腐木、树皮和动物粪便中最为普遍[4,5]。同时这种独特的子实体结构及其形成条件也成为粘细菌分离纯化的有效手段和分类的主要依据。
目前粘细菌的分类是以其形态特征为主要依据，如营养细胞和粘孢子的大小、形态，菌落的形态及子实体结构特征等。根据形态特征，粘细菌可分为3 个亚目，5 个科，17 个属和50 多个不同的种[1,2,6]。粘细菌种属分类的主要依据是子实体形态。但由于子实体结构经过传代培养很容易退化甚至是丢失，给这些菌株的准确分类带来了很大的困难，这也是粘细菌形态分类的局限性，尤其在进行粘球菌属（Myxococcus）与珊瑚球菌属（ Corallococcus ）， 原囊菌属（Archangium）与孢囊杆菌属（Cystobacter），小囊菌属（Nannocystis）与堆囊菌属（Sorangium）和多囊菌属（Polyangium）的种属鉴定时，种与种或属与属之间的子实体形态的差异不显著且易于变化，存在着很大主观臆断性[1,2]。
16S rRNA 基因序列作为系统发生关系的分子计时器，已广泛应用于细菌分类研究中，在粘细菌分类学上也得到了广泛的应用[7~9]。这对传统的形态分类进行了很好的补充，同时也纠正了一些形态分类的错误。粘细菌在16S rRNA 基因序列的系统进化上位于多变细菌（Proteobacteria）的delta 分支，粘细菌目（Myxococcales）包含3 个明显的系统进化分支，这3 个分支分别对应形态分类上的3 个亚目，即孢囊杆712 Deming Jiang et al. /Acta Microbiologica Sinica (2008) 48(6)菌亚目（Cystobacterineae）、堆囊菌亚目（Sorangineae）和小囊菌亚目（Nannocystineae），3 个分支之间的16SrRNA 基因同源性在73%~85%之间。在这3 个进化分支水平上，只有少数菌株其系统进化位置与形态分类的位置不一致[7,8]。但在种属水平上，16S rRNA 基因的系统发育关系与形态分类并不对应。因此16SrRNA 基因序列相似性分析不能为粘细菌相近种属的分类提供可靠的依据。
近几年来的研究表明，一些持家基因如HSP60（heat shock protein）基因具有高度保守的一级结构，且广泛存在于细菌和真核细胞内，是系统进化分析的有效分子标记，在近缘细菌间的系统发育关系的分析中显示优于16S rRNA 基因序列分析之处[10]。本文对15 株孢囊杆菌亚目的粘细菌根据形态特征进行了分类，然后分析了菌株的16S rRNA 基因和HSP60 基因序列，及其形态分类和序列系统发生的相关性。结果表明粘细菌在属水平上，形态分类和16S rRNA 基因的系统进化关系具有很好的一致性；但在粘细菌种水平上，HSP60 基因序列分析显示出优于16S rRNA 基因的解决方法，能够有效的揭示粘细菌种间的系统发育关系，是区分相近粘细菌的可靠分子方法。
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基于16S rRNA 和HSP60 基因序列分析粘细菌孢囊杆菌亚目形态分类的种属之间的亲缘关系
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