生物工程学报 Chin J Biotech 2008, March 25; 24(3): 381-386
journals.im.ac.cn Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061
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鸡氨肽酶H 在大肠杆菌中的表达、纯化与部分酶学性质分析
赖庆安1, 刘树滔1, 卢菀华1, 陈莉1, Toshihide NISHIMURA2, 饶平凡1
1 福州大学生物科学与工程学院, 生物工程研究所, 福州 350001
2 Graduate School of Biosphere Science, Hiroshima University, Japan
摘 要: 氨肽酶H(Aminopeptidase H, APH))是生物组织内一种常见的氨基内肽酶, 但因为天然材料中含量很低, 基本无法深入研究其催化机理、功能与结构的关系及其在生物体内的确切功能。从鸡肝组织克隆了APH 的全基因序列, 并把该序列亚克隆到载体pET22b(+)上, 然后转化大肠杆菌Rosetta(DE3), 构建了APH 的表达菌株。该菌株经IPTG 诱导, 在SDS-PAGE 上明显出现一条与天然APH 理论分子量一致的新增蛋白带, 该条带的浓度随着表达时间的延长逐渐加深; 6h 基本达到平衡, 此时重组蛋白占总蛋白的16.7%, 表达水平高达94.7 mg/L。对表达产物进行了活性检测、纯化和酶学性质分析, 发现重组蛋白在亚基构成, 热稳定性, 最适pH 等方面与天然APH 基本相同, 据此可以确认表达产物确实是APH, 发酵液总活力达到1636 u/L。这些结果为APH 的催化机理及其在生物体内的功能的阐明奠定了重要的物质基础。
关键词: 氨肽酶H(APH), 表达, 纯化, 酶活
Expression in Escherichia coli, Purification and Enzymatic Properties of Chicken Aminopeptidase H
Qingan Lai1, Shutao Liu1, Wanhua Lu1, Li Chen1, Toshihide Nishimura2, and Pingfan Rao1
1 The Institute of Biotechnology in Fuzhou University, Fuzhou 350001, China
2 Graduate School of Biosphere Science, Hiroshima University, Japan
Abstract: Aminopeptidase H (APH) is an universally distributed aminoendopeptidase in the tissue of many organism. However, it is hard to investigate its mechanism underlying the catalysis and the function in cell. In this paper, the full DNA sequence of this enzyme was cloned from chicken liver, then subcloned to the vector pET22 b(+). The recombined vector was transformed into E. coli Rosetta(DE3), and the APH gene was expressed by the induction of IPTG. It was found the recombinant protein exhibited same molecular weight as authentic APH on SDS-PAGE analysis; the expression level increased with induction time and approached maximum of 94.7mg/L till 6 hours, which contained 16.7% of the total protein. Moreover, this recombinant protein showed similar properties of subunit composition, thermal stability and optimum pH with native APH, based on the enzymatic assay, purification and analysis of enzymological properties. Therefore, it is confirmed that APH was expressed in this prokaryote system with a high-level of 1636 u/L aminopeptidase activity. These results would help to elucidate the catalysis mechanism and biological function of APH by providing enough material.
Keywords: aminopeptidase H(APH), expression, purification, enzymological properties
氨肽酶H(Aminopeptidase H, APH))是广泛分布在哺乳动物组织中的一种氨基内肽酶(aminoendopeptidase),其重要特点是与组织蛋白酶H(cathepsin H)一样同时具有氨肽酶和肽链内切酶的活性。它最早发现于兔子骨骼肌中, 当时命名为水解酶H(hydrolase H)[1,2], 随后Nishimura 等对其酶反应方式进行了研究(1983)[3]。之后Nishimura, Rhyu 等对猪肉、鸡肉和牛肉中氨肽酶H 的部分性质分别进行了表征[4.6]。这些研究说明APH 在动物肌肉中主要是作为肽链端解酶存在, 与其他水解酶协同作用, 水解各种小肽底物时起到互补的效果, 是影响宰后动物肌肉成熟过程中形成风味肽与自由氨基酸的主要水解酶之一[4.6]。其他的研究推测APH 对细胞内各种蛋白质的成熟与降解起到一定的作用, 所以对体内荷尔蒙水平的调节、细胞周期的控制等生理过程或者不可或缺[7,8];同时作为一种组织蛋白酶, 氨肽酶H 还可能参与了细胞凋亡以及肿瘤等病理过程[9,10]。对氨肽酶的研究多在发现新来源、新蛋白上, 较少深入研究催化机理、功能与结构的关系及其在生物体内的确切功能。
H Adachi 等对该酶基因进行了克隆并在COS 细胞中进行了表达, 为朝这些方面的努力奠定了基础[11], 但是表达水平极低, 无法最终满足要求。所以, 本文尝试在大肠杆菌中对该酶的基因进行表达, 并对表达产物进行纯化、表征。因为原核生物表达系统的表达量大大高于天然来源的材料,容易获得大量的重组蛋白质, 可望为进一步认识该蛋白的各种理化性质, 了解蛋白质结构与功能的关系, 以及实际应用奠定良好的物质基础。
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