生物工程学报 Chin J Biotech 2008, March 25; 24(3): 363-367
journals.im.ac.cn Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061
cjb@im.ac.cn . 2008 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reserved
研究报告
猪产肠毒素大肠杆菌987P 蛋白受体的鉴定
朱国强1, 王建业1, 朱晓芳2
1 扬州大学兽医学院, 扬州 225009
2 江苏省苏北人民医院, 扬州 225001
摘 要: 产肠毒素大肠杆菌(ETEC)定植于仔猪肠道的第一步是通过987P 菌毛与小肠上皮细胞表面刷状缘大分子(BBV)结合。对分离的BBV 进行SDS-PAGE 和Ligand blot 分析表明, 在32~35KDa 区域内有一条带能被987P 菌毛探针所识别和结合, 所结合的条带经胰蛋白酶消化后, 通过微内径反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离出多条主要峰带蛋白峰带,采用衬质辅助激光解吸与电离质谱法(MALDI-MS)对主要峰带进行分析, 结合多肽氨基酸测序和Blast 同源性比较, 得到3 个氨基酸基序(AETAP、ALAAAGYDVEK 和LGLK), 其序列与人和鼠源的组蛋白H1 高度同源; 来源于仔猪小肠上皮细胞BBV 的H1 蛋白与BBV 一样都能特异性结合纯化的987P 菌毛蛋白。上述结果表明, 仔猪小肠上皮细胞BBV 的组蛋白H1 是987P 菌毛蛋白的受体。
关键词: 产肠毒素大肠杆菌, 987P, BBV, 组蛋白H1, 受体
Identification of the 987P Protein Receptors for Enterotoxigenic Escherichia coli
Guoqiang Zhu1, Jianye Wang1, and Xiaofang Zhu2
1 College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 2250091, China
2 Northern Jiangsu People Hospital, Yangzhou 225001, China
Abstract: The 987P fimbriae of enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) mediates adhesive interactions with brush border vesicle (BBV) of the intestinal epithelial cells from the neonatal piglets. By adhering to intestinal epithelial cells, producing localized multiplication, the 987P ETEC can progress to mucosal surface colonization and concomitant effective enterotoxin delivery. To identify the receptors for the 987P, BBV proteins from piglet intestinal villous epithelial cells were separated by SDS-PAGE and analyzed by Ligand blot, protein bands with a set of 32~35 kD recognized by the 987P fimbriae were subjected to in gel proteolysis with trypsin. The tryptic fragments were separated by microbore reversed phase HPLC(RP-HPLC), samples shown to contain one major peak by MALDI-MS were submitted to Edman sequencing, three peptides were sequenced successfully and the all of three peptides matched the sequences of human or porcine histone H1 proteins. Porcine histone H1 proteins isolated from both piglet intestinal epithelial cells and BBV demonstrated the same SDS-PAGE migration pattern and 987P-binding properties as the 987P-specific protein receptors from piglet intestinal brush border did. The above results indicated that the 987P protein receptors are piglet BBV-derived Histone H1 proteins.
Keywords: enterotoxigenic Escherichia coli, 987P, BBV, Histone H1 proteins, receptor
在国内, 987P 产肠毒素大肠杆菌(ETEC)所致仔猪黄痢的严重性及多种疾病(如猪瘟、猪繁殖障碍综合征等)与ETEC 混合、并发感染的复杂性一直困扰着养猪业[1,2]。ETEC 与共生非致病性大肠杆菌不同,其致病性决定于它们在宿主上皮细胞上的定居能力和产生肠毒素的能力, 两者缺一不可。ETEC 定居在小肠上皮细胞的能力是由菌体表面的宿主特异性肠吸附菌毛(粘附素)介导的。病原菌感染机体的第一步也是最重要的一步就是粘附素和宿主细胞表面相应的特异性受体结合, 而介导细菌的定居、宿主细胞信号传递和适当途径的毒素传递, 从而引发机体的一系列的病理过程, 直至细胞、组织器官死亡。因此, 从分子水平上研究病原菌粘附素与宿主细胞表面受体相互作用的精确机制, 才能最直接、最有效地阻止病原菌侵入机体细胞, 这是当前病原菌预防和控制研究的最活跃领域[7]。大多数菌毛能作为凝集素(lectin)介导与不同种类动物红细胞相互作用,结合于宿主细胞表面糖蛋白或糖脂受体的糖基部位上。与大多数ETEC 菌毛不同, 987P 不能凝集哺乳动物红细胞或需用化学法处理红细胞后才能获得凝集性[8], 它仅能与易感仔猪小肠上皮细胞或肠上皮细胞刷状缘大分子(BBV)结合, 但小肠上皮细胞BBV 大分子上存在何种蛋白质(受体)与987P 粘附素结合？多年来兽医界和生物学界试图寻找987P 蛋白的受体而未果。本文对987P 蛋白质受体的分离和鉴定方法作如下研究。
Received: May 16, 2007; Accepted: August 8, 2007
Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 30571374), Jiangsu National Science Foundation (No. BK2005049), the
projects-sponsored by SRF for ROCS, SEM and USDA project (No. 2002-35204-12216).
Corresponding author: Guoqiang Zhu. +86-514-87972590; Fax: 86-514-87972218; E-mail: yzgqzhu@hotmail.com, yzgqzhu@yzu.edu.cn
国家自然科学基金(No. 30571374); 江苏省自然科学基金(No. BK2005049); 教育部留学回国人员科研启动基金资助项目。部分工作在美国宾夕
法尼亚大学兽医学院微生物实验室完成和美国农业部USDA 高新技术2002-35204-12216 部分资助。
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