杨友，陈惠金，钱龙华，蒋明华
（上海第二医科大学附属新华医院，上海 200092）
摘要：目的 探讨脑缺氧缺血（HI）对葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter1，GLUT1）和葡萄糖转运蛋白3（glucose transporter3，GLUT3）合成的影响。方法 在成功建立了缺氧缺血新生大鼠模型的基础上，应用免疫组化方法检测缺氧缺血新生大鼠脑内海马和皮质部位GLUT1和GLUT3的合成情况。结果 正常情况下，海马和皮质部位GLUT1和GLUT3的合成量随日龄增加而增高。海马部位的合成量高于皮质部位；缺氧缺血可引起GLUT1和GLUT3的合成增加，HI后24h时达到高峰，其后呈下降趋势，尤其是GLUT3在HI后7d降至极低水平。皮质部位的合成量高于海马部位。结论 HI可调控脑内GLUT1和GLUT3水平，使其在HI后短期内合成增高，以增加脑内葡萄糖的转运，适应无氧酵解增加的需要。
关键词： 婴儿；新生儿；脑缺氧缺血；葡萄糖转运蛋白1；葡萄糖转运蛋白3
中图分类号：Q 文献标识码：
Effect of cerebral hypoxic ischemia on the synthesis of glucose transporters 1 and 3 in neonatal rats
YANG You, CHEN Hui-jin, QIAN Long-hua, JIANG Ming-hua
(Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Second Medical University, Shanghai 200092，China)
Abstract： Objective To explore the effect of cerebral（hypoxic-ischemia）HI on the synthesis of glucose transporter( GLUT)1 and 3. Method Based on the successful preparation of hypoxic-ischemic neonatal rat model, immunohistochemical method was applied to detect the synthesis of GLUT1 and GLUT3 in cerebral hippocampus and cortex in neonatal rats with HI. Results There was a linear enhancement in the synthesis of GLUT1 and GLUT3 with the increase of day age. The synthesis was predominant in hippocampus comparing to that in cortex in normal group. However, HI could significantly enhance the synthesis of GLUT1 and GLUT3 in the early time after HI. The synthesis reached peak at 24 h after HI, and then declined, especially GLUT3 went down to a very low level at day 7 after HI. It was noticed that the synthesis was more in cortex than that in hippocampus in HI group. Conclusion It is suggested that the increased synthesis of GLUT1 and GLUT3
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30070789） 通讯作者：陈惠金 作者简介：杨友（1976－），男，回族，河南人，硕士，从事新生儿缺氧缺血性脑病的发病机制及防治研究 E-mail： 联系电话： （021）65790000转7416
收稿日期：2003-07-06
induced by HI could accelerate the utilization of glucose in the brain and adapt to the requirement of anaerobic glycolysis.
Key words： infant; neonate; brain hypoxic-ischemia; GLUT1; GLUT3
近年来研究表明，缺氧缺血导致脑内代谢异常乃至能量衰竭，是引起脑组织损伤坏死的重要原因之一。脑的生化代谢特点决定脑组织必须依赖于葡萄糖的持续有氧氧化才能维持正常的脑代谢活动。体内葡萄糖由血液通过血脑屏障进入脑细胞，需要相应的运载工具，一组葡萄糖转运蛋白就起着运送葡萄糖进入相应组织的作用。目前已证实体内至少有5种以上葡萄糖转运蛋白异构体，其中GLUT1主要位于脑内血管内皮细胞，GLUT2位于体内肝、肠、肾及胰腺β细胞部位，GLUT3位于神经细胞部位，GLUT4位于脂肪、心肌及骨骼肌等部位，GLUT5则主要位于小胶质细胞部位。在脑内，负责运送葡萄糖的转运蛋白主要为GLUT1和GLUT3，在其所在于的相应内皮细胞及神经细胞内均有较高含量。脑内也可检测到GLUT2,GLUT4以及GLUT7，但含量甚低[1]。在脑的能量代谢过程中，GLUT1和GLUT3这两个直接涉及脑内葡萄糖的转运和利用的蛋白质起了十分关键的作用。研究显示，不仅不同的血糖浓度可调节GLUT1和GLUT3的生成增高或降低，使脑内能量代谢的恒定需要得以维持，而且GLUT1和GLUT3的生成也受缺氧缺血的调控，从而显著影响GLUT基因的表达和相应蛋白质的翻译合成，乃至影响脑的能量代谢甚至能量衰竭[1~3]。本研究在成功建立了缺氧缺血新生大鼠模型的基础上，应用免疫组化方法，在国内首次对缺氧缺血新生大鼠脑内GLUT1和GLUT3的合成进行定量测定和分析。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂 一套缺氧装置包括缺氧箱[4]、恒温槽和8％低氧源等、恒冷切片机（德国Leica公司CM900）、光学显微镜以及手术器械等；GLUT1 和GLUT3多克隆抗体、ABC试剂盒（Santa Cruz公司）。
1.2 实验动物及分组 7日龄SD新生大鼠，无性别选择。由第二军医大学动物中心提供。75只新生大鼠随机分成正常组、假手术组、缺氧缺血组共3组，每组25只；每组又分成 2，24，48，72 h和7d共5个时段，每时段5只。
1.3 脑缺氧缺血（HI）新生大鼠动物模型的建立 7日龄新生SD大鼠仰卧固定于手术板上，酒精局部消毒，显微剪作颈部正中切口，分离和结扎右颈总动脉，随后将缺血后新生大鼠置恒温37℃,8%低氧箱内缺氧2h。各组新生大鼠均返回母鼠身边继续喂养。其中假手术组模型的制备为在颈部作一切口，分离右颈总动脉后不予结扎，缝合颈部切口[5]。
1.4 脑标本制备 处死前应用4％多聚甲醛心脏灌注内固定15min后，各组新生大鼠于相应时段断头处死，脑组织置于4％多聚甲醛固定6h，随后移至30％蔗糖溶液内，放置4℃冰箱内待大脑组织下沉（约需时2d）。取出大脑予OCT包埋剂包埋，置－80℃冰箱内待冷冻切片。
1.5 冷冻切片 应用恒冷切片机（德国Leica公司CM900）进行由额至枕部的冠状位全脑组织冷冻连续切片，选择脑片部位相当于耳间线前2mm水平[6]，脑片厚约8μm。
1.6 GLUT1和GLUT3的免疫组织化学检测 脑片滴加足够的0.3％H2O2 PBS液，室温下孵育10min，漂洗后用5％驴血清孵育1h，再用一抗（切片只加一种多克隆抗体，GLUT1为1:100稀释于阻断血清，GLUT3为1:100稀释于阻断血清）湿盒内25℃孵育2h；漂洗后滴加二抗（生物素标记驴抗羊抗体，按血清75μl : PBS 5ml : 二抗25μl比例配制）湿盒内25℃孵育1h；按常规ABC法反应检测，行DAB显色反应，苏木精复染5min，中性树脂封固。阴性对照则用 PBS代替一抗。
1.7 结果评估 应用KS400图像分析系统，光学显微镜400倍下观察大脑海马CA1区、CA2区、CA3区、CA4区、齿状回（DG）区以及皮质区部位GLUT1和GLUT3的合成情况。血管内皮部位呈现棕色阳性染色提示有GLUT1的合成，神经元部位呈现棕色阳性染色提示有GLUT3的合成，海马和皮质各观察10个视野。计算各视野棕色阳性染色面积占该视野总面积的百分率，然后综合10个视野的数据，得出平均阳性率，以此分析和判断各组各时段在不同脑区内GLUT的合成情况。数据以均数±标准差（ ）表示，应用单因素方差分析及Newman-Keuls检验进行均数间两两比较。
2 结果
2.1 正常组、假手术组和HI组脑内GLUT1在各时段的合成情况 正常组与假手术组在海马及皮质部位GLUT1的合成量随日龄增加而相应增加，海马部位的合成量略高于皮质部位的合成量。缺氧缺血可明显增加海马部位和皮质部位GLUT1的合成，皮质部位GLUT1的合成量普遍高于海马部位，在HI后2h GLUT1合成增加，HI后24h至48h合成量达高峰，其后合成量渐趋下降。至HI后7d，海马和皮质部位GLUT1的合成量均降至相当于对照组HI后2～24h的水平。
2.1 正常组、假手术组和HI组脑内GLUT3在各时段的合成情况 与GLUT1的合成相似，正常组与假手术组在海马及皮质部位GLUT3的合成量随着日龄的增加均有相应增加的趋势，海马部位的合成量略高于皮质部位的合成量。缺氧缺血可明显增加海马部位和皮质部位GLUT3的合成，皮质部位GLUT3的合成略高于海马部位，在HI后2h GLUT3的合成增加，HI后24h至48h合成量达到高峰，其后合成量渐趋下降，至HI后7d，海马和皮质部位的合成量均显著低于对照组水平。
3 讨论
发育因素及缺氧缺血均可调控GLUT1和GLUT3的基因表达和产物合成，由此影响脑的发育及脑的能量代谢[2,3,8]。围产期脑缺氧缺血损伤是导致新生儿死亡及神经系统后遗症的主要原因，缺氧缺血常导致脑内代谢异常甚至引起能量衰竭，因而缺氧缺血很可能是调控GLUT1和GLUT3的基因表达和产物合成的重要因素之一。 本研究在熟练掌握缺氧缺血新生大鼠模型制作的基础上，采用GLUT1和GLUT3多克隆抗体，应用免疫组化方法对缺氧缺血新生大鼠脑内的GLUT1和GLUT3进行测定，并应用KS400图像分析系统计算GLUT1和GLUT3合成的阳性染色面积百分率，从而对正常和缺氧缺血新生大鼠在不同时段及不同脑区内的GLUT1和GLUT3的合成情况进行比较评估。
在免疫组化图像中，相对分子质量为55 000 的GLUT1蛋白质位于脑血管内皮部位，呈条梭状棕色阳性染色；相对分子质量为45 000 的GLUT3蛋白质则位于脑组织神经元的突触末梢及小的突起部位，呈小斑片状棕色阳性染色[9]。
结果显示，正常新生大鼠在生后7～14日龄期间，其脑内GLUT1和GLUT3的合成量呈线性逐渐增加趋势，反映了随着脑组织的逐渐发育，其脑的能量代谢需求也逐渐增加。假手术组的结果与正常组相似，因而可以排除因单纯手术对实验的可能影响。GLUT1和GLUT3在胚胎期即有大量合成，胚胎期主要以葡萄糖的无氧酵解为主，大量合成GLUT可以和此期的能量代谢方式相适应。随着胎内三羧酸循环所需呼吸链的发育成熟，能量代谢方式渐以有氧氧化为主，GLUT的合成逐渐减少直至出生。由于生后发育代谢的需要，葡萄糖的摄入增加，促使GLUT的合成也逐渐增加，以适应发育代谢的需求[6]。已知GLUT的基因表达和产物合成主要受HIF-1、葡萄糖、生长因子等因素的调控。其中HIF-1可以调控数个涉及能量代谢包括GLUT的基因表达，HIF-1是由HIF-1α及HIF-1β组成的异二聚体，其中HIF-1α对于HIF-1调控GLUT的表达可能起决定作用，HIF-1β则主要在胚胎脑发育期起作用[10]。
本研究结果显示，缺氧缺血可明显增加GLUT1和GLUT3的合成量，其中GLUT1在HI后2h合成增加，HI后24h合成量达到高峰，其后合成量渐趋下降，至HI后72h，合成量回落至对照组水平。在皮质部位的GLUT1合成高峰较海马部位延续更长时间，持续至HI后48h才渐趋回落。同样，GLUT3在HI后2h 合成增加，HI后24h至48h合成量达到高峰，其后合成量渐趋下降，至HI后7d，GLUT3的合成量则显著低于对照组水平。研究表明血糖浓度本身也可调控GLUT的合成量，且在较高浓度下显示对神经元高度的保护作用。本课题组另有实验显示，在整体水平上，HI应激可使血糖浓度升高至(7.19±0.52)mmol/L，与正常组（5~7 mmol/L）、HI合并轻度高血糖组(10~15 mmol/L)及HI合并重度高血糖组(16~25 mmol/L)血糖水平均有显著意义差异。
缺氧缺血时，脑内缺氧且能量物质匮乏，脑组织只能依赖于效率极低的葡萄糖的无氧酵解，此时GLUT的合成增加主要受HIF-1α的调控，GLUT1的合成增加可加快葡萄糖由血液转运入脑，GLUT3的合成增加则可加速神经元的葡萄糖摄入，得以补偿脑内能量物质的严重匮乏，适应无氧酵解的需要，改善脑内能量物质的供应。
GLUT3是位于神经元部位、负责供给神经元能量的转运蛋白。本研究结果显示，GLUT3的合成量在HI后7d显著低于对照组水平。引起这一现象的原因，推测可能与缺氧缺血晚期，由于存在神经元的坏死和丢失，导致蛋白质的合成中断，从而引起GLUT3的合成量明显降低有关。位于海马神经元部位的GLUT3减少更为明显，也提示神经元的损伤在海马部位较之皮质部位可能更趋严重。引起缺氧缺血晚期GLUT3合成量降低的其他可能解释尚有，缺氧缺血可引起脑内一氧化氮（NO）及一氧化碳（CO）水平的升高，两者均可降低HIF-1α对GLUT3基因的转录活性[11]，因而减少了GLUT3的合成。此外，缺氧缺血可引起GLUT3的蛋白变性，可能未能被特异性的GLUT3相应抗体所检测到 [2,3]。对脑的神经病理研究也显示[2]，缺氧缺血后神经元可处于不同的溶解阶段，在缺氧缺血早期即可发生GLUT3表达的中断，在缺氧缺血晚期，随着神经元损伤程度的加重和进一步坏死，GLUT的合成被进一步影响，也可解释为在缺氧缺血晚期GLUT3合成量减少的原因之一。由于GLUT3的水平降低或消失，使脑内能量匮乏的恶性循环进一步加剧，还可影响其对突触合成递质的特殊作用[12]。本室分研究对脑缺氧缺血新生大鼠模型成功进行了GLUT的合成研究，结果提示缺氧缺血是调控GLUT合成的重要因素之一，在缺氧缺血早期可引起GLUT合成的上调，反映了脑内存在着应激缺氧缺血的代偿机制。缺氧缺血晚期则可导致GLUT合成的降低，提示由于神经元的进一步坏死和丢失，可能使蛋白质的翻译合成功能受阻。GLUT合成的下调，可进一步加剧脑内能量匮乏的恶性循环。对HI新生大鼠的脑病理研究和相应GLUT的基因研究正继续中，期望与本室分研究结果一起为继续进行不同葡萄糖浓度对缺氧缺血新生大鼠脑内GLUT合成的可能影响研究奠定基础。
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