石 瑛 译
北华大学医学院(吉林省 吉林市 132000）
摘要：心理和生理应激是研究免疫系统和神经系统之间相互联系的最好例证。已经证实，应激可以明显影响白细胞的细胞构成、免疫应答和对各种疾病的易感性。急性应激表现为免疫应答能力的提高；慢性应激经常造成免疫抑制的出现。在检验慢性应激的许多标准中，人们评价了淋巴细胞有丝分裂应答和淋巴细胞构成的变化。我们已经报道，慢性限制性应激可以使淋巴数目减少，这种效应的发生依赖于内源性类阿片的作用。有趣的是，人们发现这种内源性的类阿片效应可以提高细胞凋亡受体Fas的表达，并提高了淋巴细胞凋亡的敏感性。肾上腺切除术对应激诱导的淋巴细胞减少无影响。本综述基于目前可提供的文献和最新的研究数据，我们将讨论下丘脑-垂体-肾上腺轴和内源性类阿片的作用，并研究慢性应激调节淋巴细胞凋亡的机制。
关键词：慢性应激 内源性类阿片Fas(CD95) 凋亡 皮质类固醇 免疫抑制 淋巴细胞
1、 简介
生理和心理应激对免疫系统的影响早在上世纪40年代已经受到人们的关注。不同模型系统的各种研究已经证实，根据心情和应激经历时间不同，免疫系统的功能可以增强亦可以减弱。然而，慢性应激往往导致免疫应答的下调。已经证实，启动免疫应答的急性应激依赖于下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA），但是，慢性应激对免疫系统的作用机制还不明了。我们的研究证实，慢性抑制性应激诱导的淋巴细胞减少是由于内源性类阿片可以介导Fas的表达，然后，通过Fas诱导了细胞的凋亡。在这篇文章中，我们将简要介绍淋巴细胞凋亡以及凋亡在维持淋巴细胞自我平衡和免疫应答中的作用，并主要介绍慢性应激诱导的淋巴细胞凋亡和控制凋亡过程中的机制。
2、 凋亡和淋巴细胞的自我平衡
凋亡是存在于所有有核多细胞动物细胞中的一种进化严格的"细胞自杀"程序。尽管在自然界中，其具有高度的保守性，但只是在最近才确认了凋亡的某些分子机制。众所周知，凋亡是以蛋白酶的活化、染色质的自我破坏、核浓缩，细胞膜出现囊泡和内容物相呈囊泡为特征的细胞死亡过程。在发育和病理、生理进程中指导细胞死亡的基因对于扩散和精细限制过量细胞的生长发育具有作用。在免疫系统中，凋亡发生在淋巴细胞库选择和对各种疾病的应答的生理过程中。
在T细胞中诱导细胞死亡的活化是证明凋亡发生的最好系统。我们已经证实，可以在体内通过抗体对T细胞抗原受体TCR的调节，来特异性的诱导未成熟的胸腺细胞的凋亡。这种现象，通过将任何抗体与CD3或超抗原-葡萄球菌外毒素-B相结合，在小牛胸腺组织孵育中可以观察到。在未成熟的胸腺细胞中，AICD是T细胞在胸腺中的发育过程中，自身反应T细胞的负选择发挥作用，通常成熟的T细胞可以抑制AICD的发生。然而，当原始处于活化状态的T细胞被进一步活化时，大多数的T细胞则进入凋亡状态。人们已在鼠和人的细胞中证实了AICD的作用。过量的外周血淋巴细胞消失的基本机制的假设，这种假设认为免疫应答后，保持免疫自我平衡的机制部分源于凋亡的发生。程序化移除机制中的缺陷将导致自身活化淋巴数目的增多；另一方面，过多的凋亡可以导致免疫缺陷，在获得性免疫缺陷综合征中，HIV诱导的T辅助细胞凋亡就是一个实例。另外，一些治疗性制剂，如类固醇激素，也可以诱导过量的T细胞凋亡。我们最新的实验表明，外源性类阿片或刺激诱导的内源性类阿片均能通过在体内外诱导Fas，从而在淋巴细胞中启动凋亡的发生。这个发现也许与吸毒者和承受慢性应激个体的免疫抑制状态有关。
3、 Fas(CD95/APO-1)和Fas配体（FasL/CD95L）
Fas抗原是分子量45KD的Ⅰ型膜蛋白，属肿瘤坏死因子（TNF）和神经生长因子家族。它表达于包括活化的T、B细胞，肝细胞和卵巢内皮细胞的各种细胞型表面。在乳腺癌、卵巢癌、结肠癌和肝癌的癌组织中均可检测到Fas。带有特异性抗体分子的Ligation或它的配体- FasL，经常诱导细胞的快速凋亡，使之死亡；另一方面，FasL是一种分子量40KD的Ⅱ型膜蛋白，属肿瘤坏死因子家族。FasL可以表达于活化的T细胞、NK细胞、睾丸滋养层细胞、角膜上皮细胞和眼视网膜细胞中。肿瘤细胞中亦表达FasL，但是肿瘤中的FasL具有逃脱免疫监视的机制。在外周血T细胞中，AICD依赖于Fas和FasL之间的相互作用，但是TNF在此过程中已亦发挥了重要的作用。在Fas(lpr)和FasL(gld)之间的相互作用可以引起鼠和人类淋巴细胞病变，并造成脾肿大和加速自身免疫病的发生。我们的研究已经揭示，TCR活化诱导表达的Fas是通过以依赖TDAG51模式由原位PKC介导的。然而，FasL的表达则需要PKC活化和钙的内流。另外，Fas的表达受内源性或外源性类阿片的调节。
4、 类阿片和免疫抑制
鸦片是一种非常常用的药服，来源于鸦片罂粟的乳状乳汁。鸦片作为一种止痛药物已被使用了几个世纪。吗啡是一种存在于类阿片中的初级生物碱，类阿片对痛觉、意识、自我控制、情绪和自律功能都有影响，而且经常诱导精神依赖和成瘾。在上世纪70年代中期，科学家们已经发现，在大脑中存在有内源性的类吗啡物质-脑啡肽，在哺乳动物和人体中，人们已确认了几种内源性的类阿片物质。外源性或内源性类阿片通过特异性表面受体发挥作用，这些特异性受体的分子量均为60KD。目前将其分为三种：μ、δ和κ。
不同类阿片受体的存在，主要通过药理学途径得以证明。因为类阿片与各种类阿片受体的亲和力不同，且具有不同的药理学背景。类阿片的拮抗剂-纳络酮和纳曲酮，将特异性的封闭这些受体。这些抑制剂具有类阿片相关的化学结构，可以结合到受体上并置换类阿片。因此，这些药物多作为对类阿片的解毒药物使用。最近，MOR-1、DOR-1、KOR-1和OLR-1的分子克隆已经获得成功，了解到编码各种各样的类阿片受体基因位于不同染色体的不同基因位点上。目前已知，所有的这些受体菌为D-蛋白家族，其拥有7个跨膜区域。
令人感兴趣的是，淋巴细胞也具有类阿片受体。在活化状态时，可以与内源性的类阿片肽作用。在对小鼠的实验中，向小鼠体内注射吗啡，可引起胸腺和脾中的淋巴细胞凋亡和发育不全。类阿片已证实可以减少骨髓细胞增殖。事实上，未成熟的CD4+CD8+细胞对于吗啡的作用是最敏感的细胞。最近的研究表明，胸腺细胞的减少源于凋亡的发生。大量的证据又一次证实，类阿片对天然和获得性免疫均可发挥作用。
5、 慢性应激诱导的淋巴细胞凋亡
各种研究已经清晰地证明免疫系统对于生理、心理应激是非常敏感的。在人类和动物实验中，应激已经被证明是一种免疫调节子，可以改变肿瘤发展的病理过程以及自身免疫和病理过程的演变。尽管急性应激通常对免疫系统执行正效应，慢性应激则往往导致免疫抑制，而这种抑制至少部分地引起淋巴细胞数目的减少。应激诱导的淋巴细胞数目的减少在外科手术病人中、运动过量的运动员和各种心理应激下的人以及身体受限的动物中均可被观察到。由于凋亡研究的快速发展，人们设计了各种检测细胞凋亡的方法。通过使用这些技术，人类发现由于暴露于应激中而引起的白细胞减少症实际上是由于凋亡诱导的。
我们应用身体受限鼠作为实验模型，验证慢性应激时对鼠淋巴细胞凋亡的影响。我们将7-9周鼠龄的BAL/C鼠限制其活动2天，每天限制活动的时间为12小时，发现这种受限的鼠的脾细胞集落受到很大的影响，通过受限鼠与未受限对照鼠相对比，受限鼠脾中的淋巴数目减少30-40%，为了证明是否是由于凋亡引起的细胞死亡，我们应用末端脱氧核苷转移酶介导的d-UTP毛地黄毒素缺口末端标记（TUNEL）分析，我们发现，在TUNEL阳性细胞中具明显的提高，说明脾细胞集落减少是由于凋亡诱导的，最起码部分原因是由于凋亡诱导的结果。
在暴露于应激状态12小时或更长的时间的小鼠，其外周淋巴组织中由应激诱导的凋亡已经很清楚，同时应激亦引起胸腺中凋亡，明显提高和胸腺细胞数目的减少。有趣的是，胸腺对应激表现得更为敏感，处于应激环境6小时，即可出现胸腺细胞的凋亡。在所有胸腺细胞集落，CD4+CD8+细胞是最为敏感的，说明凋亡主要影响的是未成熟表型的细胞。
在最近的研究中，Dominguez-Gerpe和Rey-Mendez研究了慢性应激对T细胞各群落的影响。尽管慢性应激具有使淋巴细胞数目减少的趋势，但是在不同的群落中表现不一。成熟的T细胞比B细胞更易发生凋亡。有趣的是，循环中未成熟的T细胞（CD3+PNA+）数目反而增加。在骨髓中T细胞数目增加最明显，说明慢性应激可能对细胞的迁移也具有一定的作用。
在外科手术中，我们观察到T细胞凋亡的数目增多。在T细胞凋亡的诱导中单核细胞似乎发挥了重要的作用。来自于应激病人的单核细胞与T细胞共同培养，其可以诱导T细胞的凋亡，然而，与无应激病人的单核细胞共培养的T细胞则不发生T细胞的凋亡，这种结果说明，应激病人的单核细胞是提供给淋巴细胞细胞死亡信号的细胞。
6、 机制
神经和免疫系统之间的双向联系是通过神经内分泌机制和淋巴组织之间的相互作用实现的。很明显，活化这些途径的心理、生理应激能使免疫和疾病抗性发生转变，在此，我们着重介绍内源性类阿片、Fas、糖皮质激素和自由基的作用机制。
6.1 内源性类阿片
尽管我们已经知道在一些组织或器官上具有内源性或外源性类阿片的受体，对于类阿片的生理学功能的研究多数来源于对神经细胞的研究。然而，在体内和体外的各种试验中证实，类阿片对免疫系统也具有重要的影响。众所周知，在神经系统与免疫系统的相互作用中，内源性类阿片发挥重要的作用。人们利用外源性的类阿片来证明，在淋巴细胞凋亡的调节中类阿片受体的作用。外源性类阿片对凋亡的影响首次于1993年在胸腺中得到证实。实验者发现，注射入体内的吗啡可以诱导未成熟胸腺细胞的凋亡。值得说明的是，外源性类阿片对免疫系统的作用似乎是通过μ－类阿片受体发挥作用的。
在我们的研究中，应用类阿片受体的特异性的拮抗剂－纳络酮和纳曲酮－来验证在脾中应激诱导的淋巴数目的减少内源性类阿片的作用。尽管用类阿片拮抗剂作用的小鼠的脾细胞数目与无应激鼠脾细胞数目相比的确没有明显的改变，但是纳络酮和纳曲酮却先于生理限制的作用而封闭了应激诱导的淋巴细胞数目的降低。当人们利用TUNEL分析法来分析脾细胞的凋亡时，发现上面提到的两种拮抗剂可以抑制TUNEL阳性细胞的出现。因此，生理限制所诱导的淋巴细胞数减少与内源性类阿片相关。
6.2 Fas
Fas- FasL之间的相互作用在免疫系统的调节中是有极其重要的。我们已经报道，在体内内源性类阿片的作用能够诱导Fas表达于包括脾细胞在内的各种组织细胞上。用Fas可溶性蛋白封闭Fas- FasL之间的相互作用, FasL抗体可以封闭吗啡诱导的淋巴细胞数目的减少。这也说明在类阿片诱导的免疫抑制中Fas的重要作用。令人惊喜的是，我们也发现慢性限制性应激诱导的淋巴数目的减少亦与Fas表达相关。我们发现限制性应激能够提高Fas在淋巴细胞上的表达，为进一步验证在应激诱导淋巴细胞减少中Fas的作用，我们用血清注射小鼠，这些血清来源于SCID小鼠（SCID小鼠是携带有3T3纤维肉瘤，可以大量分泌可溶性Fas-Ig的小鼠）可以观察到其可以在在脾细胞中封闭了淋巴细胞的减少。然而，正常鼠的血清则不能发挥如此的作用。当含血清的Fas-Ig用蛋白A-Sopharose珠吸收时，这种保护效应则被去除。另外，Fas-Ig血清不能改变无应激鼠脾细胞的数目。我发现，封闭CD95L的抗体-MFL3，不仅具有独特型，而且可以封闭应激诱导的脾细胞数目的减少，因此，Fas- FasL之间的相互作用对于应激诱导的淋巴数目的减少是极其重要的。为进一步证实在生理应激下诱导的淋巴数目减少中Fas的作用，我们在实验中使用常染色体Fas隐性突变鼠－C3H/HeJ，并进行适当的背景控制，发现身体限制应激仅诱导C3H/HeJ鼠的脾细胞数目的减少；而在C3H．MRL．Fas19r鼠中则未发现。由于Fas突变而使其功能丢失鼠失去了对应激诱导的淋巴数目减少的敏感性，所以进一步支持了Fas在应激应答中的明显作用。
最近的研究报道，限制大鼠的活动可以促发大鼠睾丸小管内细胞的凋亡。因为已经有报道，在睾丸的滋养层细胞可表达高水平的FasL。在此种模型系统中的凋亡也许是通过应激诱导的Fas表达来介导发生的。这一点我们可以回忆我们曾经提到的淋巴细胞试验。尽管我们已经证明了Fas在应激诱导的淋巴细胞减少的作用，但是我们不了解FasL起源。在我们的实验中，还没有找到在淋巴细胞中如何诱导FasL的产生。对FasL起源的进一步研究对于理解应激是如何影响免疫系统是极为重要的。
6.3 糖皮质激素
高剂量的类固醇激素具有免疫抑制的作用。实际上，Wyllie于1980年用地塞米松处理大鼠胸腺细胞首次明确了基因组中DNA片段与凋亡相关的200个碱基对。这个发现使许多调查者赋予凋亡于类固醇激素的特点。有意义的是，在应激诱导的免疫系统调节中，类固醇激素具有重要的作用。然而，在文献中的研究已经在应激作用中挑战类固醇的这种作用。我们应用鼠肾上腺切除术来验证在限制性诱导的淋巴细胞减少的作用。让肾上腺切除鼠和安慰鼠均处于限制应激状态下，我们发现，限制应激诱导的两组鼠中无明显的差别，因此，PHA轴在慢性限制性应激模型中似乎不涉及到脾细胞数目的减少。我们对慢性应激诱导的脾细胞数目减少的脾切除术的效应的缺乏是相对于肾上腺在应激状态下诱导迟发型超敏反应的报道。这种不平衡似乎导致了应激持续时间和评价曲线的确定。事实上，McEwen等已证实，脾是一个相对特殊的部位并相对难产生类固醇激素，因此我们所观察到的这种肾上腺在慢性应激诱导的脾细胞减少相对是次要的，这也说明了内源性类阿片作用似乎直接作用于脾细胞。
最近的研究指出，在胸腺细胞中应激诱导的凋亡被氢化考的松介导。由Freier和Fuch所做的试验表明，在体外接触吗啡的胸腺细胞不能诱导凋亡，表明在体内吗啡的作用是间接的。然而，拮抗剂纳曲酮可以完全封闭这种作用。更进一步，体内吗啡调节的作用可以被糖皮质激素受体拮抗剂RU-486阻断。说明，在这个过程中，PHA轴具有重要作用。因此，纵观所有的文献，在未成熟的细胞中应激诱导的凋亡是通过PHA轴起作用的，而成熟的T细胞则由内源性的类阿片直接介导。
6.4 自由基
由过量产生的前氧化剂或抗氧化剂减少引起的氧化还原反应失衡在凋亡的调节，尤其是在免疫系统的细胞中，发挥重要的作用。各种研究表明，抗氧化剂可以封闭应激诱导的淋巴细胞数目的减少。有研究表明，在氧化作用应激下，淋巴细胞更趋于发生凋亡。然而，对细胞死亡敏感的氧化还原机制还不明了。根据我们在应激诱导的淋巴细胞中Fas与FasL相互反应的作用中，我们推测在应激条件下产生的氧化还原作用可以启动Fas诱导的凋亡。为了验证这一假设，我们用过氧化氢和JO2（FAS拮抗剂抗体）分别处理或共同处理未受应激鼠的脾细胞，并通过DNA含量分析法来分析细胞的凋亡。我们发现，无论是过氧化氢或JO2单独使用，均可使诱导凋亡下调。然而，两种拮抗剂同时加入培养液中时，在经历了凋亡之后，细胞的数目明显增加。因此，我们相信，Fas的表达和氧化还原及Fas之间的相互联系是非常重要的。通过启动Fas的凋亡的分子机制的进一步研究，可以更好的理解应激是如何对免疫系统发挥作用的。这说明氧化剂的应激在淋巴细胞中程序性死亡中是一种生理介导素。HIV是一个说明这方面问题的很好的实例。
6.5 淋巴细胞凋亡和癌
在40年前，Lewis Thomas和Macfarlane Bunet就提出了免疫监视的理论。陈述了免疫系统在抗癌中的免疫监视作用。在这些理论中指出，每一个体的任何时间约有2-5个细胞具有形成肿瘤的能力。尽管免疫监视的最新理论提出在免疫监视中T细胞的重要作用，但仅仅是在最近，人们才能在T缺陷鼠中观察到由致癌物质诱导的皮肤癌增加的现象。很明显，健康的免疫系统对于抗肿瘤是非常重要的。有研究表明，免疫缺陷，无论是免疫抑制试剂诱导的还是由于感染而来的，经常伴随有高的肿瘤发生率的危险。
已经报道，HIV感染导致Hidglain's病，多发性骨髓瘤，脑癌和睾丸癌等的发生率明显增加。另外，在HIV感染的条件下，免疫系统失去了控制疱疹和其他病毒感染的能力，这种缺陷导致了这些恶性肿瘤的发生。值得注意的是应激可以降低对疱疹感染的抗性，这样由于长期处于应激状态而造成的这种免疫缺陷，也可导致肿瘤病毒感染率的增加。这些处于感染应激下的个体，其自身的免疫系统已经发生了弱化，具有癌症的高发性危险。
除了肿瘤病毒可以提高感染率外，应激也表现为可以提高细胞型别的转换率。Keicolt-Glaser等报道，最近从病人分离出的淋巴细胞表明，慢性疾病应激可以降低DNA修复能力。因为损伤DNA数目是细胞转型的主要原因。这个研究提供了在应激和癌中一个重要的联系。进一步研究表明了在应激鼠中，甲基转移酶－NA修复过程中的一种重要的酶－明显减少了。另外，表明忍受游泳应激的鼠可以诱导染色体改变。因此，象肿瘤感染，应激直接诱导的基因组的改变也能提高癌症的发生率。
因为淋巴细胞减少症与心理和生理应激相关，所以淋巴细胞数目的减少已经被发现与癌肿的发生率以及肿瘤的生长具有相关性。我们已经讨论了应激导致淋巴细胞减少，应激提高了肿瘤病毒感染和DNA损伤。最近的研究表明，一些肿瘤细胞能高表达FasL，这个机制也许是肿瘤细胞可以脱逃免疫系统的监视，根据我们在应激条件下淋巴细胞Fas表达上升的研究，由Fas的提高而启动表达于肿瘤细胞上的FasL诱导的淋巴细胞凋亡是可信的。因此，免疫系统被进一步弱化。
7、 总结
慢性应激经常导致免疫系统抑制，在本文中，我们总结了在应激条件下与应激诱导淋巴细胞凋亡相关的文献，基于以上知识，了解到应激诱导的淋巴细胞的凋亡在各种疾病的病理过程中发挥重要作用。许多证据表明，免疫系统折衷是癌发生的主要原因，并能影响癌症治疗的效果。我们相信，对于淋巴细胞如何承受应激诱导凋亡的研究为防止和处理感染性疾病和癌的发生将提供新的策略。
