秦娜琳 译
新乡医学院微生物与免疫学教研室
许多胞内病原体通过感染哺乳动物宿主诱导强的T细胞应答。在大多数情况中，这些T细胞应答起保护作用并可导致清除病原体。所以，决定T细胞如何被激活以及它们怎样分化成细胞因子分泌细胞和（或）细胞毒性细胞，是重要的。相对于B细胞识别可溶性抗原，CD8＋和CD4＋T细胞对抗原衍生肽的应答是分别与MHCⅠ类MHCⅡ类分子密切相关的。因此，阐明这一机制即病原体衍生抗原通过什么方式获得递呈，对于理解病原体怎样激发体内T细胞应答是必须的。虽然许多优秀研究者把注意力放在抗原加工这一机制上，但是很少有人指出宿主和病原体之间相互作用的特异性。在这一方面，应该注意到这些相互作用与病原体和病原体之间的相互作用，是非常不同的，而且可能导致不同细胞和分子的包容。由于篇幅所限，我们决定将这一研究集中在两种胞内病原体--牛痘病毒和单核细胞增多性李斯特菌。之所以选择这两种病原体，是由于它们都可以诱导强的CD8＋T细胞应答，也是因为微生物学家和免疫学家都在广泛研究它们。
1.引言
一些独特特性的结合使得DC成为体内激活病原体特异T细胞的最佳候选人。这些特性包括：在外周组织获得抗原的能力，迁移到次级淋巴器官以及提供辅助性T细胞和细胞毒性T细胞活化所要求的协同辅助信号。并且，除了作为APC(抗原提呈细胞)的作用外，一些DC亚型能够分泌细胞因子，从而影响T细胞的分化（如IL-12）或是促进已激活的记忆性T细胞存活（如Ⅰ型干扰素）。
关于DC在病原体抗原加工和递呈中的作用的许多知识是来源于体外研究的，在这些研究中，DC被病原体提取物所激活或是被各种病原体（包括病毒，细菌，原虫和真菌）所感染。虽然在DC接触病原体时它们做些什么这一方面，这些研究提供了新的观点，但是在自然或试验感染过程中，体内这些细胞真正做些什么这一方面仍然有待明确。这里，我们将研究我们现在所知道的在牛痘病毒（VV）和单核细胞增多性李斯特菌感染过程中DC的作用。
2.VV感染中DC的作用
2.1 VV的性质
VV存在细胞质中，应用病毒编码的聚合酶进行复制和转录，这一点和其他痘病毒科的成员是不同的。VV具有广泛的趋向性，能感染哺乳动物起源的许多细胞系。VV感染都是溶细胞性的。VV有一个大的基因组（200kb），可表达超过 100种不同的蛋白质，其中一些能引起强的免疫反应。并且，它可以产生许多重组VV（rVV），包括一些能表达良好特征模型抗原的VV（如OVA），或受体基因如增强的绿色荧光蛋白（eGFP）或是β-半乳糖苷酶。这些rVV已经作为研究激活VV特异性T细胞这一机制的一种手段。
有两种形态独特的感染性病毒体，分别称为胞内成熟病毒（IMV）和胞外包膜病毒（EEV）。IMV由包绕一层或两层膜的核心组成，它一直存在于细胞质中直到细胞溶解，并能产生大量感染性后代。IMV的成分被由早期管状核内体或顺式高尔基网状系统而来的双层膜进一步包绕，形成胞内包膜病毒（IEV）。一些IEV由肌动蛋白的聚合反应推移到细胞表面，在那里，外层膜和胞浆膜融合，从细胞中释放出EEV。更重要的是，EEV的外膜介导病毒与细胞表面的结合，并且它与一些包括A56R、A34R和B5R在内的病毒蛋白有关联，而后者中的一些与毒力的大小有关。然而，哪种病毒蛋白参与病毒附着，以及它们结合哪种细胞表面受体，这一点仍然不清楚。
2.2 VV特异性CD8+T细胞
给小鼠腹腔注射或静脉注射rVV,可引起对针rVV抗原的强的CD8+T细胞应答,这一点可由实验证实。在这些实验中,我们发现已感染小鼠脾脏中提炼出的CD8+T细胞能溶解抗原-激动靶细胞.这是一高效过程,因为103VV斑块形成单位足以激活体内VV特异性CD8+T细胞.但是,哪种APC能提呈VV抗原？为了阐述这个问题，Lenz等人将照射过的F1小鼠（C57BL/6×BALB/c）与C57BI/6 BM细胞重组，构成放射 BM嵌合体。然后用VV感染嵌和体小鼠，该VV可表达来自LCMV的核蛋白抗原，从而发现它能激活H2-Db限制性的而非H2-Kd 限制性的CTL细胞应答，这就证实了BM诱导的APC对于成功激活CTL应答是所需的，该结果与早期的研究一致。
2.3 体内BM诱导的APC如何获取病毒Ag？
理论上，病毒Ag能够通过经典的MHC-Ⅰ类限制性抗原加工途径（直接激活）提呈给CD8+T细胞，在该途径中，产生于感染细胞细胞质的内源性Ag被分解成肽段，通过抗原提呈相关转运体（TAP）依赖机制运输到内质网，然后表达于细胞表面的MHC-Ⅰ类分子复合体。另一方面， APC可以从胞外获得病毒抗原，激活VV特异性CD8+T细胞，这称为交叉激活机制。交叉激活的两种途径都已被阐述：抗原在核内体水解的TAP非依赖途径以及TAP依赖的吞噬体-胞质溶胶途径。作为区别这两种可能性的一种尝试，Norbury等人选择性将CFSE标记的、OVA特异的、TCR转基因CD8+T细胞转移到TAP-1缺陷鼠，并且给这些小鼠注射表达OVA的rVV。资料证实了OVA特异性T细胞的激活发生于TAP存在时，这一结果为交叉激活能引发体内VV特异性CTL应答提供了最初证据。
2.4 与直接激活相对的交叉激活
交叉激活能否单独地引发VV特异性CD8+T细胞应答或者也包含直接激活？为了探究这一问题，两组研究者构建了表达人类CMV蛋白-US11的rVV。US11是一种内质网居膜蛋白，可以将MHC-1类的重链后转位至感染细胞的胞质溶胶，从而被蛋白酶体降解。因此，感染细胞期望表达US11以抑制病毒抗原的提呈，但是，非感染细胞能够通过交叉途径获得病毒抗原则不希望表达该蛋白。资料表明：当通过腹腔或静脉发生感染时，US11的表达能强烈地抑制诱导初始CD8+T细胞，这就证明了在诱导针对由这些途径进入的病毒的CTL应答中，直接激活是关键的。有趣的是，这一效应在肌肉注射感染是较小的，而且在皮下或皮内感染中是最低的。把这些研究放在一起考虑，可证明：随着接触VV，直接激活和交叉激活都有助于CD8+TCL的诱导，但是每一途径的各自作用依赖于感染路径而不同。结果也表明由交叉激活和直接激活产生的VV决定子的集合不是完全一致的。
尽管有以上详细的研究，但是，阐明病毒蛋白如何提呈给免疫系统，大多数最后的方法是直接看到T细胞和APC间的相互作用。为了这个目的，Norbury等人用一种rVV感染C57BI/6小鼠的足垫，该rVV可表达与OVA衍生肽相关的eGFP。在感染后6小时即可从局部排出的LN中很容易发现病毒感染的eGFP+巨噬细胞和DC。然而，由同焦点显微镜直接观察到的细胞间相互作用表明只有DC能够激活初始病毒特异性CD8+T细胞。同LN中被提呈的感染DC的数量相比，最后提呈有所下降。这些资料为病毒感染的APC激活体内初始CD8+T细胞提供了直接证据。
无论哪种类型的APC提呈VV抗原给T细胞，这些细胞提呈抗原的能力可以受到病毒蛋白或病毒诱导分子与特异表面或细胞间受体之间结合的影响，这一点是很清楚的。对于VV结合到APC表面而言，我们应该记住：两种形态不同地感染性病毒IMV和EEV可能通过不同地机制进入到细胞内，对于这些机制尽管有一些研究，但仍了解甚少。把抗原提呈看作是VV结合到APC表面有可能导致基因表达和表型的变化，这是一个重要的问题。
2.5 VV对APC功能的干扰
尽管VV可能通过结合于APC表面而影响抗原提呈,但是,间接的证据表明这种病毒能作用于已知的几种调节APC功能的信号转导途径.事实上,VV表达IL-1β、TNF-α、IFN-α/β和IFN-γ的分泌型引诱受体.另外,VV表达来源于细胞因子受体和(或)Toll样受体(TLR)的胞内蛋白,该蛋白可干扰信号转导.举例来说,两种VV蛋白-A46R和A52R-同Toll/IL-1受体(TIR)结构域有着相似的氨基酸序列,从而特异地干扰IL-1信号转导. A46R部分地抑制IL-1介导的转录因子NF-κB的活化, A52R则可以使一种TIR结构域封闭接头分子-MyD88决定性的负转动,从而有力地阻止IL-1和TLR4介导的NF-κB的活化。 A52R也可以通过多种TLR分子(包括TLR3,它是一种病毒RNA受体)阻止NF-kB的活化. A52R与IL-1R相关激酶2(IRAK-2)和TNFR相关因子6(TRAF-6)都有联系,后两者是TLR信号转导中重要的两种关键蛋白.虽然这些研究表明VV发展了几种策略以逃避免疫系统,但是它们也说明了哺乳类宿主的细胞通过分泌炎性细胞因子对VV应答,同时也表明该现象至少部分地由TLR介导.
关于VV抗原的加工可以得出什么结论?虽然DC在激活VV特异性CD8+T细胞中起着重要作用,这一点是清楚的,但是,实验数据表明:病毒抗原通过依赖于几种参数的不同机制而得以加工,这些参数包括:感染的路径和病毒决定基的性质.调查为什么是这种情况和什么规则控制这种现象将可能是进一步研究的主题.
3.DC在单核细胞增多性李斯特菌感染中的作用
3.1 单核细胞增多性李斯特菌的特点
单核细胞增多性李斯特菌是一种G+胞内菌,可侵入到吞噬细胞和非吞噬细胞内,从而引起人类和小鼠的急性感染.它的基因组包含270个菌株特异性基因,后者不存在于非致病性菌株李斯特菌.它的主要毒力因子是孔形成蛋白-李斯特菌溶素LLO,它可允许细菌从初级空泡逃到感染细胞的胞质溶胶内.另一毒力因子ActA对肌动蛋白尾的聚合作用，胞内溶质的能动性以及细胞与细胞间的扩散起重要作用。其他毒力因子包括磷脂酶和p60水解酶，前者能促进细胞间的扩散，后者能控制细菌分裂。
3.2 感染途径和感染剂量的重要性
人类常常由口服途径感染单核细胞增多性李斯特菌.细菌蛋白internalin结合上皮细胞表面表达的E-钙黏附蛋白，从而介导细菌进入非吞噬细胞内。有趣的是，单核细胞增多性李斯特菌的internalin不能结合小鼠的E-钙黏附蛋白，这一结果可以解释为什么口服感染的小鼠仅仅只对单核细胞增多性李斯特菌感染易感。基于这一假设，肠上皮细胞选择性表达人类E-钙黏附蛋白的转基因小鼠，与野生型小鼠相比，能表现出对全身细菌感染的易感性增加，并且，其感染细胞的类型也不同。由于人类和小鼠之间这种种属特异的不同，许多研究者在研究小鼠对单核细胞增多性李斯特菌的免疫应答时，采用了静脉感染途径。
有趣的是，同静脉感染相比，口服感染诱导保护性免疫需要大约超过105-106-fold细菌。同样的，腹膜感染小鼠同静脉感染小鼠相比，它们的脾脏中细菌要少10-100- fold。对静脉或口服接种后感染的进一步分析，揭示了在脾脏、肝脏和肠系膜淋巴结中细菌生长和扩散相似的动力学。然而，口服感染小鼠的肠系膜淋巴结中，细菌的负荷量比静脉感染小鼠中的要高10-1000 fold。应记住只有口服感染才允许细菌在肠管腔和固有层中复制。最新有报道应用体内生物发光成像技术对表达luxkan转座子盒的单核细胞增多性李斯特菌有作用。这一研究精确地证明小鼠在口服和静脉感染几天后，胆囊中有活性胞外细菌的生长和复制。这一令人吃惊的结果表明无论哪种感染途径，胆囊都能促进细菌生长和全身的移生。
3.3 针对单核细胞增多性李斯特菌的固有免疫
给小鼠注射单核细胞增多性李斯特菌后能迅速被清除。早期的研究表明：清除细菌需要固有免疫和适应性免疫。事实上，固有免疫系统的细胞如巨噬细胞、中性粒细胞和NK细胞，都有助于在感染后的最初几个小时内杀灭细菌。而在后一阶段活化的T淋巴细胞则为无菌免疫所依赖。并且，抑制3型补体受体能阻止骨髓单核细胞募集到肝脏和脾脏，同时可以显著增强体内单核细胞增多性李斯特菌的增殖。同样地，感染前清除中性粒细胞能导致细菌生长的无控制性。
虽然固有细胞早期清除单核细胞增多性李斯特菌需要IFN-γ和TNF-α，但是杀灭细菌也依赖由诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）生成反应性氮中间物。最近，Serbina 等人将这些 iNOS 产生细胞同Tip-DC进行区别，后者是CD11c+细胞中的一种亚型，能分泌TNF-α，而且可以通过CCR2依赖机制募集到感染小鼠的脾脏。有趣的是，虽然CCR2缺陷小鼠不能控制细菌的生长，但是，这些小鼠中李斯特菌特异性CD8+T细胞的激活不受损害。因此，尽管Tip-DC 对于最初清除单核细胞增多性李斯特菌很重要，但是发生长久持续保护性免疫不需要它们。虽然大量的Tip-DC 和 iNOS 产生细胞不被感染，但是这些细胞的活化并不可能来自同一机制。
同一作者也证实：Tip-DC募集到脾脏分为两步。第一步是MyD88非依赖性，但是依赖于单核细胞趋化蛋白（MCP-1），该蛋白是CCR2的主要配体。相对的，第二步是MyD88依赖性，它可导致单核细胞分化为Tip-DC。应用两种逃避初级空泡能力不同的李斯特菌突变体可进一步证明：感染细胞产生MCP-1需要细菌胞内溶胶质的局部化。
3.4 单核细胞增多性李斯特菌特异性CD8+T细胞
无论固有细胞对于清除单核细胞增多性李斯特菌有何作用，非致死量的细菌感染可诱导强的持久的CD8+T细胞应答，这一应答能为另一致死量的再次感染提供保护。CD8+T细胞介导这一保护性的T细胞应答，这可由应用排除抗体清除了这些细胞的实验证明.在BALB/c小鼠，至少有3个H2-Kd限制性CD8+T细胞表位才能成为特征，而且可以在体内感染中获得提呈。这些表位中的其中一个来自LLO，另两个来自p60。并且也证明了单核细胞增多性李斯特菌能分泌甲酰化的肽段，该肽段在感染后可由非经典MHC 1类分子H2-M3提呈。单核细胞增多性李斯特菌感染可诱导T细胞对这些表位反应频率的短暂增加。
虽然H2-M3特异性T细胞在初次感染后迅速扩增，但是李斯特菌特异性H2-Kd限制性T细胞的频率在初次感染后8天、再次感染后5天达到峰值。虽然T细胞在对不同表位反应方面其扩增和活化的动力学是相似的，但是表位和表位之间这些细胞的最大频率是不同的，而且与细胞表面肽-MHC复合体的数量无关。这些结果表明T细胞对特异表位应答的广度不是仅仅由如何加工细菌蛋白所决定，而是可能由其他因素决定，这些因素包括固有免疫组成成分中表位特异性CD8+T细胞的频率。
3.5 哪种APC提呈单核细胞增多性李斯特菌？
尽管我们对小鼠李斯特菌特异性CD8+T细胞应答的动力学了解很多，但是，与体内李斯特菌抗原加工有关的APC和分子机制仍知之甚少。Lenz等人应用BM嵌合体，证明BM衍生的APC为激活李斯特菌特异性CTL所必需。最近，Jung等人直接追寻DC在激活李斯特菌特异性CD8+T细胞中的作用。为了这个目的，他们应用转基因小鼠，这些小鼠的DC选择性表达白喉毒素受体（DTR），因此允许体内这些细胞的诱导性的短期的ablation。资料表明DC减少鼠不能激起针对单核细胞增多性李斯特菌感染的CTL应答，进一步证明体内激活李斯特菌特异性CD8+T细胞需要这些细胞。
虽然BM诱导的DC在激活李斯特菌特异性CD8+T细胞中起着重要作用，这一点是毫无疑问的，但是相对于交叉激活而言，直接激活的有关作用仍然是个有争议的问题。Shen等人构建了一种重组单核细胞增多性李斯特菌，作为研究该问题的间接方法。这种细菌能表达LCMV核蛋白抗原，作为一种分泌型或非分泌型的熔解蛋白。这两种形式的抗原，要么分泌到宿主细胞的胞质中，要么保留在细菌内，从而有效地激活CD8+T细胞应答。然而，那些已经被LCMV预先激活的小鼠可以保护性地抵抗那些表达分泌型熔解蛋白的李斯特菌，而不能抵制那些表达非分泌型的。因此，这些结果不仅表明：分泌型的和非分泌型的Ag都能被加工、提呈给初始T细胞，还可表明：不同的细菌Ag能够通过多种I类提呈途径而获得提呈。然而，尽管这些研究的作者认为这些胞浆内分泌的蛋白质通过内源性MHC-I类提呈途径获得提呈，但是，对这一假说还缺乏规范的证明。
另一方面，实验数据表明：对于单核细胞增多性李斯特菌有效激活CD8+T细胞这一过程来说，进入APC的胞质溶胶并不是必须的。实际上，表位特异的CD8+T细胞能够被活的野生型细菌和来源于野生型或LLO-缺陷细菌的热死亡单核细胞增多性李斯特菌（HKML）有效激活。因此，尽管这么多的研究，我们仍然不知道：直接激活或交叉激活、抑或两者的组合，对于天然小鼠CD8+T细胞的激活是否起作用。探究这一问题可能需要使李斯特-感染细胞和原位李斯特-特异CD8+T细胞形象化，这样一种方法已经成功的用于研究在VV-感染小鼠中VV-特异性T细胞的激活（见上文），但是，对单核细胞增多性李斯特菌来说，这种方法有待实施。
3.6 单核细胞增多性李斯特菌抗原如何加工？
体外数据表明：从细菌分泌蛋白而来的抗原肽，其加工和提呈的有效性受到表位-侧翼序列的调节，并且依赖于N-末端规则。在另一研究中，Vihj等人用能分泌不等量p60水解蛋白的单核细胞增多性李斯特菌突变体感染小鼠。在由不同单核细胞增多性李斯特菌突变体感染的细胞中，抗原加工的有效性达到20-fold范围。而用低效地分泌加工过的p60（1表位为350个降解的p60分子）的突变体感染小鼠，则不能激起p60特异性T细胞应答，由因子5增加抗原加工的有效性可修复T细胞应答尺度致正常，但是进一步增加p60产生的有效性则无效。这一研究证实了体内T细胞活化存在抗原加工阈值。令人奇怪的是，一旦达到这一阈值，抗原加工有效性的进一步增强作用并不能增强T细胞应答的程度。同样，蛋白酶体抑制剂能够消除体外感染细胞中细菌分泌蛋白的降解。
虽然控制感染需要IFN-γ，但是IFN-γ的产生并不能影响非分泌型抗原的交叉激活。抗原分泌到感染细胞的胞质溶胶中也为激活体内保护性CD8+T细胞所需要。这是通过实验证明的，在该实验中给小鼠注射针对分泌型或非分泌型细菌抗原的特异性CD8+T细胞系，并且鉴定针对细菌的抵抗力。有研究表明：将H2-M3限制性CD8+T细胞转导至TAP-1缺陷鼠，可提供抵抗单核细胞增多性李斯特菌的部分性保护。
3.7 T细胞的激活
无论哪种分子机制有助于激活李斯特菌特异性CD8+T细胞，在感染小鼠中李斯特抗原的加工发生非常迅速。因此，在那些适量地转移了李斯特菌特异性CD8+T细胞的小鼠中，可以发现感染后12小时就有早期活化标志CD69的上调。成功激活CD8+T细胞并不需要持续的抗原提呈。通过应用氨苄西林以消除在感染后不同时段复制的细菌便可证明这一点。所以，尽管在最初24小时内给予小鼠抗生素可显著减少李斯特菌特异性CD8+T细胞的激活，但是，在后一时期甚至在记忆性T细胞应答发生阶段给予抗生素时，这一措施无效。
另一方面，当李斯特菌特异性、TCR-转基因T细胞转移到72h前注射过单核细胞增多性李斯特菌的受体鼠，则发现不能激活T细胞。这是由于单核细胞增多性李斯特菌特异性CD8+T细胞能够杀死APC，而在RAG-2缺陷鼠中不能取消T细胞的激活则可证明这一点。Wong等人把资料合起来阐明，李斯特菌抗原在感染后能迅速得到加工，24小时就足以诱导保护性的长久持续的CD8+T细胞应答的发生。但是，在这最初24小时中究竟发生了什么？
虽然李斯特菌特异性T细胞的激活依赖于APC对细菌抗原的加工，但是，这一T细胞应答的本性也提出是由一些附加因素决定的，这些因素包括：细胞因子和（或）其他细胞的补充。令人奇怪的是，保护性CD8+T细胞应答的发生既不需要IFN-γ，TNF-α，也不需要IL-12。然而，一些给小鼠注射活的细菌或是HKLM的研究则明显支持这一观点：即固有机制对T细胞应答的质量有强大的影响。事实上，虽然活的细菌和热杀死的细菌都能诱导T细胞应答，但是只有活的细菌能够诱导保护性的长久持续的T细胞应答。因此，HKLM注射鼠中，保护性免疫的缺乏不是由于细菌抗原的MHC-Ⅰ类加工途径的减弱，而是由于HKLM触发公认的细胞溶质内信号转导途径的失效。
尽管已有上述研究，但是，对于单核细胞增多性李斯特菌感染小鼠中最初感染细胞的本性我们仍所知甚少。同样地，证实单核细胞增多性李斯特菌在细胞内时哪种监视途径能够发现它们，仍需要做更多的工作。在这一方面，新近表明：属于Nod 蛋白家族的蛋白能够监测到G-菌肽聚糖衍生来的胞壁酰二肽。证实这一家族的蛋白是否也可以作为胞内模型识别受体以监测G+单核细胞增多性李斯特菌，这将是有趣的。
4 .实际得到的信息
我们已经广泛应用病原体作为工具去研究免疫系统如何工作。然而，应记住用病原体注射的小鼠同那些用重组蛋白如OVA或鸡卵溶菌酶免疫的动物相比，是非常不同的。因此，发现来自VV或单核细胞增多性李斯特菌的抗原能够被多种加工途径加工，而这些途径依赖包括感染的路径和病原体因子性能在内的几种参数，我们不应惊奇。调查事实为什么是这样以及操纵这一现象的规则是什么，这将是进一步研究的主题。
虽然DC在病原体衍生抗原的加工中起着重要作用，但是，它们也可以分泌细胞因子反作用于激活的T细胞的分化和（或）存活。并且，由于淋巴器官含有许多不同的DC亚型，所以,确定这些亚型中的任一种是否进行特异的工作以及它们如何协同允许一次成功的T细胞应答，这将是重要的。另一关键问题是破译DC发现病原体存在的监测途径。就胞内病原体来说，这些途径很可能是多样的、病原体特异的以及包含了通过不同机制识别胞外和胞内病原体。
