器官移植教育部重点实验室（华中科技大学）
华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所，武汉 430030
摘要 小鼠和人类体内的调节性T细胞介导机体特异性免疫耐受，能抑制自身免疫性疾病，并介导肿瘤免疫和器官移植免疫。最近发现转录因子Foxp3基因及其编码产物scurfin参与调节性T细胞的中枢性和外周性生成过程，并影响调节性T细胞免疫调节功能的发挥。CD4+T细胞表面表达的scurfin可能是调节性T细胞的特异性标记。而转导了Foxp3mRNA的细胞表达scurfin后，部分表现出免疫调节功能。
关键词 Foxp3 scurfin 调节性T细胞 免疫耐受
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高等动物的免疫系统能够保护机体免受病原微生物的侵害，并可通过一系列复杂的中枢以及外周免疫机制形成针对自身抗原的免疫耐受，从而避免免疫系统对自身抗原进行攻击。具有抑制功能的调节性T细胞即在免疫耐受的形成过程中发挥重要作用
二十世纪七十年代，有学者发现有一群T细胞可介导机体特异性免疫抑制1。但由于没有找到明确的表面标记，这方面的研究进展缓慢。直到1995年，Sakaguchi等发现给nu/nu小鼠输注清除了CD4+CD25+双阳性细胞亚群的CD4+细胞会引起器官特异性自身免疫性疾病的发生；而同时输注CD4+CD25+细胞可以避免这种自身免疫性疾病的发生2。这一发现，为当时调节性T细胞的研究提供了一个可靠的表面标志。近十年，随着对CD25、CTLA-4和TGF-β这些与调节性T细胞鉴别和功能密切相关的分子研究的深入3,4，人们开始关注调节性T细胞在维持机体免疫耐受状态，防止自身免疫病的发生，抗移植物排斥以及肿瘤免疫中的重要作用2,19。
然而，调节性T细胞的特异性表面标记一直是争论的焦点之一，因为部分CD4+CD25-T细胞也具有免疫抑制功能5，同时CD25和CTLA-4也是细胞活化的标记，并非调节性T细胞所独有的表面标志。
调节T的生物学特性
近期有研究表明， Foxp3基因编码的产物可能对调节性T细胞的生长以及功能发挥起重要作用6,7,8。而且，Foxp3并非细胞活化的表面标记，而是具有免疫抑制功能的细胞所共有的标记。
1.Foxp3研究简史
Foxp3基因的编码产物为一个48-kDa的蛋白质scurfin，其特征性结构为蛋白C端的叉头螺旋（forkhead/winged helix）结构，这一结构域内的蛋白质属于DNA结合因子家族成员之一。除了叉头区，scurfin还包括一个C2H2锌指结构以及亮氨酸拉链序列，但是没有磷酸化的PKB/AKT位点13。scurfin属于转录调节子，主要作用是抑制转录，主要表达于淋巴组织的CD4+T细胞，但在CD8+细胞和B细胞则基本上不表达17。体外实验表明，scurfin以IL-2依赖的受体作为转录阻遏物，但是体内确切的靶点仍不清楚。
在scurfy（sf）缺陷的突变小鼠内可以观察到CD4+T细胞相关淋巴细胞增生病,这种疾病是由于Foxp3的编码产物scurfin功能缺失造成的，其表现与缺乏CTLA-4以及TGF-β的小鼠相似18。
2001年，Wildin 和Bennett 同时提出人类Foxp3基因与sf突变小鼠的Foxp3基因具有同源性9,10，该基因突变引起免疫失调性基因疾病、多发性内分泌腺体病、小肠免疫性疾病、X－相关综合症（IPEX；也称为X－相关自身免疫性变应性失调综合症，XLAAD）等，这些疾病的一个共同特征就是整体免疫失调。
随后，Roli K等发现，scurfin高表达的小鼠免疫系统处于抑制状态11。将Foxp3基因导入小鼠后发现，T细胞数量明显减少，低于正常水平，并且这些T细胞的增殖能力和溶细胞能力均较低，在TCR的刺激下分泌的IL-2水平降低。虽然这类小鼠的胸腺发育正常，但是其外周免疫器官，尤其是淋巴结，表现出无细胞状态。这说明Foxp3影响了小鼠外周免疫系统的发育和功能状态。 2003年，Hori S等几乎同时发现6,7,8，Foxp3和调节性T细胞的发育和功能相关。因此，O'Garra A将Foxp3称为"21世纪的Foxp3"。12
2. Foxp3与调节性T细胞的关系
2.1 scurfin在调节性T细胞特异性表达
Fontenot使用PCR技术和western blot技术，分别证实了Foxp3mRNA和scurfin蛋白在正常小鼠体内的CD4+CD25+T细胞比CD4+CD25-T细胞高。从而考虑Foxp3在调节性T细胞表达具有特异性。
通过向患有淋巴细胞减少症的小鼠体内输入转导了Foxp3的CD4+CD25-T细胞发现，这些细胞不但没有诱导出消耗性疾病，反而抑制了供者CD8分子的增殖，进一步证实了Fxop3在调节性T细胞获得其调节功能的过程中起重要作用。随后从受者体内分离这些表达scurfin的细胞进行检测，发现它们高表达IL-10mRNA，这与CD4+CD25+调节性T细胞特性相同。Hori等证实6，转导了Foxp3的 CD4+CD25-T细胞同样可以抑制淋巴细胞增生小鼠的炎性肠病（IBD）以及胃炎的发生，且在体外可以抑制初始T细胞增殖。然而，在这个实验中，即使在导入受者小鼠体内之前给Foxp3转导细胞以抗CD3的刺激， 分泌的IL-10也很低。这说明Tr细胞高IL-10mRNA表达的机制非常复杂，或者这是只在体内才具有的特征。
然而，有研究表明使用TCR和CD28的抗体刺激不能诱导出小鼠CD4+CD25+T和CD4+CD25-的Foxp3mRNA产生，说明它并非细胞活化的标志。这就将scurfin从其他可能的调节性T细胞的表面标志如CD25，GITR分开，因为那些标志也在活化细胞表面表达。
2.2 Foxp3和scurfin对调节性T细胞功能的作用
Roli K等的研究指出，scurfy小鼠和Foxp3缺失小鼠的CD4+T细胞中均有一个细胞亚群表达CD25分子的同时大量表达CD69，但是正常小鼠的调节性T细胞仅表达CD25而不高表达CD69分子。在体外培养中，scurfy小鼠和Foxp3缺失小鼠的CD25+细胞在刺激下均能增殖，且不具有调节活性。因此上述两种小鼠体内T细胞 CD25的表达是伴随着淋巴细胞增生失调的细胞活化的结果，并非一个调节性亚群细胞的标志。此外，Rudensky等发现向新生的scurfy小鼠输入CD4+CD25+T细胞可以预防这种淋巴细胞增生失调的发生，说明由Foxp3缺失导致CD4+CD25+T细胞的不足是引起淋巴细胞增生失调的关键。
Foxp3的mRNA表达和调节性T细胞的相关性说明了两者在功能上有一定关联。缺乏功能性Foxp3基因的小鼠和人都会发生自身免疫性疾病，说明Foxp3在控制T细胞活化中起到重要作用。为了直接证实这一点，许多实验组都使非调节性T细胞表达Foxp3，随后检测它们的表型及功能。使用逆转录病毒转导Foxp3或者在转基因动物模型中高表达scurfin，其结果均显示在体外获得了表面不具有CD25分子但是具有调节性T细胞功能的细胞，其中包括CD8＋细胞。但是这些细胞的抑制能力与Foxp3的数量并不成正比，说明Foxp3在细胞获得抑制作用的过程中起了重要作用，但是细胞仅有Foxp3不足以表现出其抑制功能。
Devorah等使用转基因高表达scurfin的小鼠模型（Foxp3 Tg小鼠）研究15，发现其成熟性、功能性T细胞数目较正常小鼠低。使用T细胞依赖抗原免疫的这类小鼠的血清里抗原特异性Ig数目减少，脾脏结构混乱。而在体外培养实验中，B细胞的应答正常，说明该类小鼠抗体低应答缘自体内T细胞辅助功能缺陷。而这类小鼠的CD4+T细胞CD40配体数目下调，分泌IFN－γ数量也减少。这说明高表达scurfin的小鼠体内的CD4+T不能提供辅助B细胞对T细胞依赖抗原应答的信号。
2.3 Foxp3和调节性T细胞的生成关系
非调节性T细胞表达Foxp3后也能抑制体内的自身免疫疾病发生。Foxp3相关细胞的一个重要特征是组成性表达CD25和GITR，这与天然调节性CD4+CD25+T细胞相同。在Fontenot等构建的混合骨髓嵌合体模型中，即有Foxp3＋细胞，也有Foxp3null细胞，这说明所有的CD4+CD25+调节性T细胞都是源自Foxp3基因。因此，Foxp3可以调控调节性T细胞的生成。
由于表达Foxp3的CD4+CD25+T细胞和CD4+CD25-T细胞均可以抑制体外TCR刺激下的T细胞活化和扩增4,5,6，人们考虑了两种可能的CD4+CD25+T细胞发源途径：①在TCR刺激下，初始T细胞可以分化为CD4+CD25+调节性T细胞，这一途径可能类似于转导因子T-bet和GATA-3诱导初始细胞分化为Th1，Th2；②胸腺产生的一部分功能成熟的调节性T细胞为CD4+CD25-T细胞，或者胸腺来源的CD4+CD25+T细胞失表达CD25分子后，还保留了其抑制功能14。
Hori和Khattri的数据表明，高表达Foxp3的细胞与Foxp3阴性细胞相比，对T细胞的刺激反应较低，这主要表现在细胞反应性增殖以及IL-2、IL-10的产生上。而在混合骨髓嵌合体模型的细胞细胞中，却发现表达Foxp3的CD4+CD25-T细胞在TCR刺激下正常增殖，且有数据表明Foxp3的表达与IL-10mRNA数目增加相关。这一T细胞功能的差异是与Foxp3表达数目相关，还是与细胞纯化手段或者与体内细胞分化相关，目前尚不清楚。值得注意的是逆转录病毒转导细胞和Foxp3转基因细胞在体外不能如同天然CD4+CD25+调节性T细胞一样高效率的抑制CD4+CD25-T细胞增殖，这可能与这一群细胞的异质性有关，因为在本实验系统中无法确定所有表达Foxp3的细胞都是天然CD4+CD25+调节性T细胞。因此Foxp3基因的存在可以指挥细胞发育成调节性T细胞谱系，但这些细胞的最佳功能尚需要其他的因素进行调控。
现在已经证实人体内的CD4+CD25+T细胞部分表达Foxp3，并且Foxp3+的这群细胞具有免疫抑制功能。但与小鼠不同的是，使用TCR和抗CD28单抗联合刺激CD4+CD25-T细胞，生成的CD4+CD25+T细胞表达Foxp3，这些细胞也具有调节性T细胞的抑制性功能16。
3．影响scurfin生成的因素
诱导Foxp3基因表达的因素以及可以表达这个基因的细胞群，可以决定调节性T细胞生成的机制。CD4+CD25+T细胞在胸腺选择的过程中，Foxp3的mRNA可以由TCR的交互作用来直接控制Foxp3的表达。此外，胸腺APC细胞，如表达AIRE的胸腺髓质上皮细胞就可能跟CD4+CD25+调节性T细胞生成有关。但调节性T细胞内的Foxp3+亚群是否也有在外周生成途径，以及哪些因素可控制这一过程，目前仍不清楚。在胸腺发育过程中这一基因的表达产物不足以抑制其他Foxp3null动物的疾病。这说明对于维系调节性T细胞的功能，Foxp3在外周的继发表达也很重要。
尽管Foxp3对于调节性T细胞活性的作用令人关注，但这是否是Foxp3编码产物scurfin的唯一功能尚不清楚。高表达Foxp3的CD4+T细胞对于刺激有高反应性，且在分泌细胞因子上有缺陷，这说明了它们在免疫抑制作用上并非最佳。此外在转基因鼠内，Foxp3mRNA的数目与外周的调节性T细胞数目直接相关。这说明了调节性T（Foxp3+）细胞扩增能力受到自稳状态的限制，或者说明Foxp3编码产物对T细胞扩增发挥直接作用。因为Foxp3null和CTLA-4null小鼠表现出非常相似的表型，转基因表达的Foxp3尽管并不能完全抑制疾病发生，但可以延迟CTLA－4null小鼠的致死性变化。这些CTLA－4null/Foxp3转基因小鼠的Tr细胞可以延迟疾病，说明CTLA-4信号和Foxp3信号也有一定联系。
4.小结
Foxp3和调节性T细胞的发生、功能间的联系为我们在分子水平研究机体内这一特殊细胞群提供了依据，而Foxp3基因的表达产物在调节性T细胞表面的表达，则为我们研究调节性T细胞，提供了一个可能的特异性标记。Foxp3与介导调节性T细胞的一系列细胞因子，如CTLA-4、GITR、IL-10和TGF-β等的功能作用有着千丝万缕的联系。转Foxp3基因进入细胞诱导产生具有调节功能的细胞，则为我们把调节性细胞用于临床免疫治疗提供了一种可能。但是Foxp3基因在调节性T细胞的中枢、外周发育途径中究竟起了什么作用，它是如何参与调节性T细胞的功能发挥，以及转导Foxp3的基因是否能作为治疗自身免疫病的发生和抗移植物排斥、抗肿瘤免疫逃避的一条新途径，还有待进一步研究。
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