任华 译 黄静 校译
（华东师范大学生命科学学院，上海200062）
通过将目的基因导入异常细胞中以减缓破坏性疾病，这一概念是十分吸引人的。然而，至今转基因技术在基因治疗中成功率还很低。不过，重症联合性免疫缺陷病是一种有用的模型，因为通过转基因可以选择性地赋予转导细胞某些有利特性，由此为基因治疗提供有力证据。
获得性免疫反应有时会降低。人体内一些自然突变都伴随有T细胞发育受阻的特征，同时也直接或间接地伴随着B细胞免疫功能下降，而且临床结果发现机体易受致病微生物的侵染，因此它们被统称为重症联合性免疫缺陷综合症（SCIDs）。重症联合性免疫缺陷综合症根据病理生理学特征可分为四类（图1）。对大多数病例都进行了分子机制的鉴定，而在一些病例中确认特定基因产物在淋巴细胞发育中的重要作用。人们很快认识到重症联合性免疫缺陷综合症有望成为评估基因治疗的模型。确实，存在各种综合因素使得基因治疗免疫缺陷症令人欢喜，例如，能找出导致SCID疾病的缺陷基因，鉴定疾病的严重性，操纵造血干细胞的可能性，同种异型干细胞移植的效力（虽然干细胞存活率不令人满意）和免疫反应的纠正。这就是为什么一旦第一个与SCID疾病相关的基因，腺苷脱氨酶基因被鉴定出来后，腺苷脱氨酶（ADA）基因缺陷症就被一些实验室确认作为基因治疗的疾病模型，这导致了1990年第一例基因治疗实现。尽管人们获得了不少信息，在接下来的试验中，转基因并没有纠正免疫缺陷。尽管如此，这些尖端研究为另一SCID疾病--X染色体相关的SCID（SCID-X）基因治疗研究提供了基础：这种病是由细胞因子受体链基因（γc）缺失造成。（2000年报道）
ADA转基因试验中获得的教训
1972年，人们认识到ADA缺陷是SCID疾病的一种，1984年与此相关的基因被克隆。人们发现，拿出该基因进行表达和行使管家功能的那部分编码区，便可进行转基因了。莫洛尼鼠类肉瘤病毒(一种逆转录病毒)可作为载体把ADA基因转入淋巴细胞生成祖先或成熟的淋巴细胞中。此逆转录病毒载体能转染造血祖细胞并把转基因插入到靶细胞基因组。此载体来源于鼠类致癌逆转录病毒。使用异种移植模型可观测到ADA基因缺失的T细胞经转基因后存活和行使其功能。与此同时，另一种治疗也很有效，即注射用PEG化的腺苷脱氨酶（PEG-ADA）的使用，腺苷脱氨酶与PEG偶联后稳定性增加。ADA缺陷病人因为ADA的缺乏，其毒性底物不断积累，若为其每周注射PEG-ADA，便能有效地替代缺失酶的功能。因此，淋巴细胞发育得到恢复，并足以让一些病人存活。
这些研究暗示基因治疗发展可超越ADA缺陷病研究范围。首先，将ADA基因转入T细胞体现了一种可行途径。这是一种吸引人的方法，因为T细胞很容易引发体内循环，故可有效利用逆转录病毒携带外源基因转导T细胞。因此，进行可行性试验后，第一例ADA缺陷临床基因治疗试验便开展了。两位ADA缺陷病人自愿加入，随后日本又有第三位病人加入。这一临床试验产生一些有趣的结果（BOX 2）。结果表明在体内血液中得到大量转导的T细胞的可能性，并且给病人注射大量转导细胞未产生不良反应。尤其是转基因随机整合入基因组，作为插入突变并没有导致有害后果。这告诉我们，比起其它任何一种实验方法，也许使用逆转录病毒载体的风险相当低。第二，至少在一位病人身上，转导的T细胞仍可在基因转导后8至10年被检测到。这最有效证明了人体内T细胞寿命，也是基因治疗淋巴系统疾病令人鼓舞的结果。然而，大部分循环T细胞并未被转导，因为研究者们不允许撤消PEG-ADA治疗。这就不能得知是否ADA基因转入T细胞并给这些病人带来任何好处。
同时，一些研究组有着野心勃勃的目标，通过在造血祖细胞中插入ADA基因而永久地纠正ADA缺陷。他们开展了三个试验：使用两个载体感染外周T细胞和骨髓祖细胞试验；以新生儿索血祖细胞为目标的试验；和以老年病人骨髓细胞为目标的试验。这儿，再次所有的病人也要接受PEG-ADA治疗。虽然，整个结果令人失望（与预期结果相比），我们仍得到一些有价值的教训。在一项实验中，三个病人接受自身转导索血细胞，一小部分白血球被转导，并能维持八年。与转导的骨髓细胞相比，存在更多易被探知的转导T细胞，结果表明转基因可能为T细胞带来选择有利性，这意味着转基因表达使造血祖细胞选择性存活生长，并且可能分化为不同优势的淋巴祖细胞。这也是强调了腺苷脱氨酶在淋巴细胞分化中的重要作用，而它在髓细胞生长中作用不大。为探测存活生长优势，必须有三个条件：转基因表达使转导细胞存活生长；转导细胞在最终分化为大量具有功能的正常细胞前必须经历几次分裂；最终的分化细胞应是长期细胞，例如T细胞。在这一研究中，ADA基因在其它的T细胞中是不表达的，用PEG-ADA阻断酶增加，减少T细胞数目和免疫性。ADA转基因表达不能恢复淋巴细胞生成。
十年后，回顾过去，ADA缺陷症并不是作为研究基因治疗的最佳模型。PEG-ADA治疗很可能消除了转导淋巴细胞祖先选择性生长优势，因为未转导的细胞能够存在并增殖。最近的实验现象证实了这一假设，将ADA基因转入一位病人的外周血液淋巴细胞中后，停止PEG-ADA治疗，可观察到T细胞数量增加和其功能。另一阻碍是因为ADA缺陷对出生的小鼠是致命的，无法造模，直到最近采用基因工程手段后才有ADA缺陷鼠模型的出现。此外，ADA缺陷对肝脏、肺和中枢神经系统都是有害的。现在仍不清楚是否正常ADA基因转入淋巴祖细胞后能消除疾病的代谢障碍。
吞噬细胞紊乱的基因治疗
编码与吞噬细胞（粒细胞、单核细胞、巨噬细胞）功能相关的基因突变，可导致人体免疫缺陷。β2整合素蛋白若基因表达活性或蛋白功能受损，粒细胞便不能迁移进入组织。如此病人便容易受到细菌感染。白细胞黏附缺陷病（LAD）即为一例。NADPH氧化酶复合体可以运输氧自由基进入吞噬体帮助吞噬微生物，若NADPH氧化酶复合体缺失，则对细菌和真菌易感，会产生慢性肉芽肿病（CGD），这种病主要是编码细胞色素b的 α、β亚基（P22PHOX，GP91PHOX）和两个细胞因子（中性细胞因子1/P47PHOX和中性细胞因子2/P67PHOX）的四个基因发生了突变。人们希望把正确的基因转入造血祖细胞来治疗这些重症。利用逆转录病毒载体，转基因已在鼠模型身上取得成功。然而，在临床实验中，在体内将正确基因转入，经CD34细胞表面阳性选择并由骨髓迁移进入血液的造血祖细胞，数量不足2%。多次注射转导细胞也不能增加数目。但未检测到免疫反应抵触转基因产物，说明不是这种原因导致转基因如此低效。这些实验采用了目前最先进的技术，包括高滴度的逆转录病毒；假GALV被膜病毒模型机制，这一机制可增加靶细胞感染机率；细胞因子的使用，可诱导CD34+细胞分裂；纤蛋白片段CH-296参与的转导，可增加转导率。尽管有这些先进技术，基因转入人体造血干细胞的效率仍十分有限。缺少选择有利性，如果只有很少的干细胞被转导，那么其检测率也将会很低。
根据我们的观点，这些遗传性吞噬细胞紊乱病也不适于进行基因治疗。由于β2整合素和NADPH氧化酶复合体只在分化了的细胞里有功能，因此不可能提供存活优势或生长优势。而且，粒细胞半衰期很短（大约2天），因此转导细胞只能在外周存活很短时间。转基因是否成功取决于分化细胞的存活，增殖和寿命。
X染色体遗传的SCID（SCID-X）的基因治疗
SCID疾病的特征是T细胞发育缺陷（有或无自然杀伤细胞）。这些缺陷是由于信号下游受体如γc（其为IL-2、LI-4、IL-7、IL-9、IL-11、IL-15和IL-21的受体）的缺损引起的。特有细胞因子于受体结合通常可激活Janus激酶（JAKs），然后，JAKs磷酸化胞内底物，包括信号转导和转录激活因子：STAT蛋白。STAT蛋白定位核内控制下游信号转导。SCID症（SCID-X）的发生是由于JAK3丝氨酸蛋白激酶基因缺失，该激酶能与γc细胞因子的尾部结合，该基因缺失后使得γc细胞因子受体亚基不能表达或以非功能形式表达；或 IL-7受体A链（IL-7RA）不表达也导致SCID症。在后一种情形中，IL-7受体A链不能表达，在T细胞受体β基因重排前，IL-7不能传递存活、增殖信号使T细胞祖细胞扩增。表达γc、JAK3、IL-7RA蛋白的淋巴祖细胞比未经校正的细胞有明显生长优势，因为至少在鼠体内，在发育阶段T细胞祖细胞的扩增是大规模进行的。
两组试验数据支持了这一假设。一是，我们观察到通过 "天然"的基因治疗，一位SCID-X患者的免疫缺陷部分地被纠正。在他的血液中，正常的T细胞很少（换句话说就是表达功能γc蛋白的T细胞很少），同时，其它细胞仍然携带突变的γc基因。这一发现只有一种解释，T细胞祖细胞自发发生回复突变，因此纠正了突变的γc基因。从TCRVβ-Jβ使用频率和CDR3编码序列显示这一例子中T细胞含有大约1%完整的TCRVβ。这些T细胞在两年内均能检测到。因此，在基因回复突变和TCRβ基因重排之间T细胞至少进行了10至11次分裂。也体现出T细胞祖细胞令人惊讶的增殖能力。二是，通过逆转录病毒载体将JAK3基因转入JAK3-1-鼠造血干细胞（HSCs）中获得免疫缺陷纠正。有趣的是，虽然T细胞转导概率为100%，外周髓细胞转导率却很低。与此同时，作为临床试验的前提，γc基因必须成功的转入γc基因缺陷鼠的造血干细胞(HSCs)中（图3）。使用逆转录病毒介导的转基因技术，能在体外纠正γc在B细胞、T细胞、自然杀伤性细胞祖细胞的表达和‰功能。
1999年开始第一例SCID-X基因治疗临床试验。病人按以下标准招募：确诊为SCID-X，缺乏同型HLA的捐赠，以及知情同意。方案依据富含CD34的骼脊骨髓细胞的体内转导。这一试验得出的数据证实选择有利性概念的正确。如果我们进一步观察病人达一年多时间，5例病人中的4例，与转导的CD34+细胞融合的淋巴细胞，在6-12周内，就细胞数目、数量分配、TCR多样性和捕获抗原活性而言，外周转导的T细胞与相同年龄对照组有相似的特征。胸腺产生的新生T细胞可以被检测到。至今，改正T细胞免疫缺陷已平均维持在3.3年。虽然B细胞转导率低，至少有一部分免疫球蛋白产物被保留。在这些病人身上免疫缺陷的纠正足够阻止临床SCID症状，例如，防止长期腹泻；此外，孩子受感染后表现出正常的反应。至今这4个孩子享受着正常生活。通过定量PCR分析和免疫荧光检测，所有在孩子血液中检测到的T细胞和自然杀伤细胞都携带并表达γc转基因，与此同时，只有不超过0.1-1%的骨髓细胞和1-5%的B细胞表达γc转基因。因此，我们使用一种相似的转基因技术转导人体CD34+细胞应用于基因治疗SCID-X症，尽管事实上它对慢性肉芽肿病（CGD）和白细胞黏附缺陷病（LAD）无任何作用。有趣的是，一些转导的骨髓前体细胞两年后都能检测到。这一现象表明某些转导的多潜能祖先在这些孩子们骨髓中存留。加上T细胞的长寿命，这一发现增加了我们对纠正免疫缺陷稳定性的希望。不过，γc基因沉默或者前体缺损就令人不太乐观。
基因治疗SCID症的未来
这些试验结果为基因治疗的潜能提供了证据，实验中转导细胞被赋予了选择优势。研究尚需大量病人范例以精确评估其治疗潜力。研究还扩展到其他免疫缺陷治疗或者造血干系统基因缺损的治疗。
遗留问题：
我们需要多少转导细胞？
这一问题的答案由在动物模型进行一定数量未转导细胞和转导细胞竞争试验的结果决定。同时根据在回复突变株上的观察结果，一个T细胞前体大约能保留～1% T细胞。如果我们按线形函数计算结果，只要提供几百个转导细胞就足够维持至少几年之内所有的T细胞正常。果真如此，由于T细胞发育缺损引起的其他T细胞免疫缺陷症就有望用基因治疗进行纠正。
自然杀伤细胞和B细胞发育的情况如何？
在SCID-X基因治疗试验中，我们发现，虽然能监测到转导的自然杀伤细胞，但它们的数目相当低。这是与接受同种异型干细胞移植的SCID患者相比较而得出的。其中原因仍不清楚，我们还在分析是否是由于自然杀伤细胞分裂或存活的局限性引起的。在SCID-X病人的CD34+细胞内转入γc基因，发现循环B细胞中转导B细胞数目的比例比转导的T细胞要少得多。这可能是与未转导B细胞竞争空间位置的结果造成。另外，也可能是由于B细胞前体增殖力太低，或是与T细胞相比，表达γc B细胞的选择优势较弱。对于B细胞缺陷引起的SCID症治疗，例如，重组激活基因（RAG1/RAG2）或Artemis缺陷，我们想知道转基因入CD34+细胞纠正B细胞免疫缺陷的可行性有多大。
转基因的最佳目标是什么？
治疗遗传性淋巴细胞缺陷，有效地将基因转入自我更新的造血干细胞是显著的解决方法。然而，目前我们临床上应用的载体系统还不能穿过干细胞的核膜。干细胞大部分是不进行分裂的，其结构完整的膜构成转基因的屏障。就SCID病人而言，假如潜在的一小部分转导细胞有效力，那么就有可能使少数分裂的干细胞能被转导，最终治愈疾病。这乐观的假设可以通过测试检验：长时间监测转导的淋巴细胞和骨髓细胞的存在与否。在鼠体内，不同环境下CLPs引起不同淋巴细胞血系，这一观点已被普遍接受。如果人体淋巴细胞系分化通道存在CLPs，将是淋巴系统特异性基因治疗的诱人靶目标，因为可避免转基因在骨髓细胞表达。由于CLPs的确潜在表达可供选择的标记，此方案就存在可行性。关键在于这种细胞的寿命，在小鼠体内，它们不具有自我更新的能力。
那些疾病可以作为基因治疗？
如果缺陷基因的野生型能赋予转导淋巴细胞祖先选择优势，就有可能进行基因治疗，应用于各种SCID症状（图1）。首先，JAK3和IL-7 Rα缺陷具有相同机制，都是SCID-X，可进行基因治疗。基因回复能部分纠正ADA缺陷表型，说明ADA缺陷同样可作基因治疗，即使不用PEG-ADA进行辅助治疗。胸腺细胞发育时，缺少V（D）J重排，会导致胸腺细胞在γc依赖细胞增殖阶段死亡。如果TCR（或B细胞受体）重排后细胞存活，淋巴祖细胞RAG1、RAG2、Artemis的诱导表达可间接提供预期的选择优势，此推测若实现极为诱人。转基因的持续表达，至少RAG1、RAG2，对成熟T细胞、B细胞而言，是非必需的，这使得基因治疗更为吸引人。我们尚需试验证明这一假设。T细胞发育受阻越迟，转基因导致T细胞前体存活发育的可能性就越小。然而，最近观察到一例患有Wistott-Aldrich综合症（WAS）的成年人部分纠正了T细胞免疫缺陷，这一发现扩展了这一概念。这位病人免疫缺陷状况的显著改进，使得基因治疗WAS症成为可能。WAS是由于编码WASP蛋白的基因突变引起，该基因为管家基因，其编码蛋白参与造血细胞中肌动蛋白-细胞骨架重排。WAS病人淋巴细胞正常发育，而T细胞的激活、迁移、存活却受到损伤。WASP基因回复突变意义重大，这也第一次证明通过T细胞前体的基因纠正，外周T细胞，至少部分外周T细胞缺陷能被克服。基因治疗主要的免疫缺陷病的范围将扩大。
如何促进转基因？
载体的局限性，就穿越核膜而言，阻碍了基因治疗进一步应用。然而，我们有两条途径可遵循。第一是，给转导细胞一阳性选择压力。转入第二个编码选择标记的基因，例如，抗药产物（多抗病性，MDR1；二氢叶酸还原酶，DHFR）或膜蛋白（IL-2受体α链，CD24），能促进转导细胞富集，应用内部核糖体进入位点（IRES）元件载体，可以独立从普通mRNA开始翻译。初步试验证明了这一可行性，但体内效用的证明还有待期待。
另一途径是改进转基因入HSCs的技术。这件重要任务需要大量工作。包括使用病毒的衣壳，例如来源于猫体内的逆转录病毒RD11的衣壳，能与HSCs表达的特异性受体以较高亲和力结合；以慢病毒载体为介质转导未分裂细胞；或者删除阻碍序列防止基因沉默。的确，慢病毒的前整合复合物，比如HIV-1能进入核膜而有效整合。这一特征的成功应用表明人体造血干细胞可有效被转导。如果，解决了HIV来源载体引起的安全问题，那么这一领域中这种载体的应用会得到重点发展。联合限制性家族表达一起使用，如血红蛋白在类红细胞中表达，此技术体现了治疗更多基因紊乱症的可行性。
分析已有成功经验，展望未来发展，我们可得出相同结论，有效的基因治疗不仅需要对疾病机制有深入了解，而且还需要发展最新可采用的技术。设计出能转导非分裂干细胞的载体，是我们的期待。
其他证据
最近，Aintietal报导，通过逆转录病毒为载体转基因入ADA缺陷病人的骨髓祖细胞，同时无需酶辅助治疗，便能持久有意义地纠正由ADA缺陷引起的免疫缺陷症。这些结果肯定了选择优势概念可有效地应用于基因治疗。
附录：
图一：T细胞发育缺陷导致重症联合型免疫缺陷综合症（SCID）
在胸腺中T细胞从T细胞前体，经过不同发育阶段最终成为成熟的T细胞，包括V（D）J重组，前T细胞受体（pre-TCR）表达、诱导扩增和TCR引起的阳性阴性选择。T细胞分化需要很多因素，一般有细胞因子受体γ链（γc）、JAK3、LI-7受体α链（IL-7Rα）、腺苷脱氨酶（ADA）、重组-激活基因1（RAG1）和RAG2、Artemis、CD3ε、CD3γ、CD45、ζ链相关蛋白、ZAP70。编码这些蛋白的基因发生突变会导致SCID或T细胞缺陷，根据病理生理学分为四组。（图中四个蓝框表示）。图示蛋白质在不同阶段的功能，ADA缺陷阶段产生的T细胞基因损伤具有高度随机性。简便起见，TCRγδT细胞发育和CD4+、CD8+T细胞分化未显示。
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图二：含有γ链细胞因子受体图解
含有γ链的细胞因子受体损伤或缺失导致下游信号传导受阻引起SCID病。γ链是IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21受体的组成成分。其中，IL-2R、IL-15R有三个亚基：α、β、γ；IL-4R、IL-7R、IL-9R和IL-21R由α、γ亚基组成。若没有γ链，正常信号传导途径--JAKs激活、信号使者磷酸化、STAT蛋白激活，受阻。至今研究确定SCID的起因包括γ链损伤和表达的γ链无功能、表达的JAK蛋白无功能（不能被激活去磷酸化STAT分子）或者是IL-7Rα链缺陷。简单起见，图示的受体为两个亚基组成（如IL-7R）。
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图三：SCID-X疾病体内基因治疗的原理
CD34+细胞与携带编码细胞因子受体γ链基因的逆转录病毒上清孵育。病毒携带基因进入细胞。病毒RNA反转录为DNA，作为前整合体复合物，与细胞基因组重组。在病毒LTR的控制下，γ链基因可被转录合成蛋白质，在细胞膜表达和发挥作用。mRNA，信使RNA。
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图四：SCID-X基因治疗试验转导过程图示
收集病人的骨髓，选出CD34+细胞。将这些细胞与提供存活和增殖信号的细胞因子一起孵育，然后转染逆转录病毒载体（一天一个周期，3天）。把细胞置于包被有CH-296的袋中，有利于病毒-细胞相互作用。经过四天完成程序，筛选出细胞注射回到病人的静脉中，无需其他辅助治疗。FACA，荧光激活细胞分选仪；FLT3L，FLT3配体；IL-3，白介素3；MFG，逆转录病毒载体；MGDF，巨核细胞生长发育因子；SCF，干细胞因子。
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Box1：逆转录载体特征
小鼠致癌逆转录病毒（RNA）
进入人体与造血祖细胞结合
原病毒整合入基因组分化细胞
随细胞分化转基因复制
在病毒LTR或内源启动子的控制下转基因表达
病毒颗粒不复制
无病毒蛋白表达
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Box2：基因治疗ADA缺陷的教训
转导的大量T细胞没有负作用
需要在动物模型上进行临床前试验
转导T细胞的寿命
转导的T细胞没有选择优势，转基因技术不能产生足够的高水平纠正
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Box3：SCID-X基因治疗成果
好处：各种T细胞发育
持久的T细胞缺陷纠正（长达三年）
T细胞多整合位点，表明T细胞有多克隆来源
病人没有随机感染的现象
局限：自然杀伤细胞数目很少（同源异型在造血干细胞转导后可见）
转导的B细胞比例少（虽然产生抗体反应）
长期结果还未知（潜在的基因沉默效应或转导前体的耗竭）
